黃酒生麥曲液化力檢測方法的建立和應用

凌夢熒,王宗敏,金建順,毛 健,*

(1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 3.江南大學食品安全與營養協同創新中心,江蘇無錫 214122; 4.會稽山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000)

生麥曲是釀造優質黃酒必不可少的原料,“以麥制曲、以曲釀酒”是黃酒釀造行業的傳統操作工藝[1-2]。生麥曲含有豐富且復雜的微生物群落結構,利用生麥曲釀造的黃酒比利用商業酶制劑釀造的黃酒具有更豐腴的口感和風味[3-4],所以生麥曲是生產優質黃酒的重要保障[4-5]。生麥曲的液化力使淀粉質原料分解為小分子物質[5-6],為后續的發酵提供營養物質和底物,液化過程處于釀造的初始階段[7],因此,液化力的高低直接反應了生麥曲品質的好壞。

工業酶制劑行業采用分光光度法[5,8]測定液化力,但是在預實驗研究中發現黃酒生麥曲的液化力與商業酶制劑的液化力相差甚遠。在實驗過程中發現對于生麥曲液化力的檢測而言,20 g/L的淀粉濃度過高,5 min的反應時間略短,導致顯色顏色過深,超出分光光度計的讀數范圍。已有學者嘗試改變反應條件,比如沙均響等[9]在檢測白酒大曲液化力時,將淀粉濃度降低至1 g/L,將反應時間延長至10 min;胡衛明等[10]在檢測黃酒麥曲液化力時,將淀粉濃度稀釋至4.5 g/L,將酶液用量增加至2.5 mL,但是后續檢測方法采用的是目視法,該方法容易受操作人員的視力和判斷力影響,測定誤差較大,存在一定弊端[11-12]。另一方面,已有學者對酒曲的浸提條件進行了研究,張志剛等[13]和張強等[14]研究了浸提溫度、時間、浸提液用量和料液比對白酒大曲液化力測定的影響,還有一些學者[13-16]研究了料液比、浸提溶液、浸提時間和浸提溫度對紅曲和米曲液化力測定的影響,結果表明浸提條件對酒曲液化力的檢測結果有著重要影響。但是,針對黃酒生麥曲液化力檢測浸提條件的研究還很少。

因此,本研究將在工業液化酶檢測方法和白酒大曲液化力檢測方法的基礎上,對黃酒生麥曲液化力檢測的反應體系進行研究,并對生麥曲液化力檢測過程中的浸提條件進行單因素實驗,最后選擇具有代表性的生麥曲樣品來驗證方法的可行性,這些樣品來自黃酒行業知名度和產量排名前四名的企業。本研究為黃酒生麥曲液化力的定量檢測以及生產過程中合理安排生麥曲的生產計劃提供了科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒生麥曲 2017年8～9月生產的塊曲,由紹興(A、B、C)和上海(D)地區的四家黃酒企業提供,每家企業分別提供3塊生麥曲,共計12個樣品;可溶性淀粉、碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

UV-1800型紫外可見光光度計 上海美普達儀器有限公司;DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 太倉市強樂實驗設備有限公司;VORTEX-GENIE 2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司;DFY-300 搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;GB/T 6003.1-2012標準檢驗篩 紹興市上虞華豐五金儀器有限公司;LC-E109S電陶爐 廣州順德忠臣電器有限公司;EL3002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將塊狀生麥曲用鍘刀粉粹,混勻后用四分法取樣500 g,再用高速萬能粉碎機粉碎,用標準檢驗篩進行粉碎度劃分,分為不粉碎、10、25、50、100、200目,收集粉碎麥曲于(4±1) ℃保存,并盡快完成測定。

1.2.2 生麥曲液化力檢測方法的確定 工業液化酶檢測方法[8]中的淀粉濃度為20 g/L,反應時間為5 min;白酒大曲液化力檢測方法[9]中的淀粉濃度為1 g/L,反應時間為10 min,浸提條件為稱取1 g粉碎大曲,加入190 mL蒸餾水,10 mL磷酸緩沖溶液,于40 ℃水浴浸提1 h,過濾得到濾液。為使黃酒生麥曲液化力檢測時的吸光度值落在合理范圍(0.1～0.8)[8]以提高檢測的準確性,本研究在工業液化酶和白酒大曲液化力檢測方法的基礎上,擬采用的生麥曲液化力檢測方法為:稱取粉碎度為25目的生麥曲樣品(Gx)1.000 g,加入90 mL蒸餾水,10 mL磷酸緩沖溶液,于30 ℃水浴浸提1 h,過濾得到濾液作為待測酶液。反應液:吸取一定濃度的淀粉溶液20 mL和磷酸緩沖液5 mL于比色管中,加入1 mL待測酶液,混勻后準確反應一定時間,立即加入200 g/L氫氧化鈉溶液0.2 mL[17]終止反應;并作空白液(先加氫氧化鈉溶液滅活,再補加酶液)。分別吸取反應液和空白液1 mL于比色管中,用去離子水稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液[9],于560 nm[9]處進行比色,記錄吸光度值。

1.2.3 生麥曲液化力檢測反應條件的確定 針對淀粉濃度和反應時間進行單因素實驗,探究其對吸光度值的影響。

1.2.3.1 淀粉濃度的確定 固定反應時間為5 min,考察不同淀粉濃度(0.5、1、2.5、5、10、20 g/L),對生麥曲液化力檢測過程中吸光度值的影響,其他條件見1.2.2。

1.2.3.2 反應時間的確定 固定淀粉濃度為1 g/L,考察不同反應時間(5、10、15、20 min)對生麥曲液化力檢測過程中吸光度值的影響,其他條件見1.2.2。

1.2.4 生麥曲液化力檢測顯色條件的確定 對顯色吸收波長、顯色劑用量和顯色反應時間這三個顯色條件進行單因素實驗,探究其對碘與淀粉顯色顏色的影響。

1.2.4.1 吸收波長的確定 吸取1 g/L淀粉溶液0.8 mL[18]于比色管中,稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液,顯色后立即進行比色。根據已有文獻[9,18-20]報道設置波長在460～700 nm范圍內(間隔20 nm變化),記錄對應的吸光度值。

1.2.4.2 顯色劑用量的確定 吸取1 g/L淀粉溶液0.8 mL于比色管中,稀釋至10 mL,根據已有文獻[9,20]按梯度加入0.1～1.4 mL(間隔0.1 mL變化)碘-碘化鉀溶液,顯色后立即在580 nm波長下進行比色,記錄相應的吸光度值。

1.2.4.3 顯色反應時間的確定 吸取1 g/L淀粉溶液0.8 mL于比色管中,稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液,使其反應0、5、10、15、20、30、60 min,在580 nm波長下進行比色,記錄相應的吸光度值。

1.2.5 生麥曲液化力檢測

1.2.5.1 標準曲線的測定 按梯度吸取1 g/L淀粉溶液0～1.2 mL于比色管中,用去離子水稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液,立即于580 nm波長下進行比色,記錄吸光度值,繪制淀粉濃度—吸光度標準曲線。

1.2.5.2 生麥曲液化力檢測重復性和回收率的測定 吸取0.3、0.5、0.9 g/L的淀粉溶液1 mL,用去離子水稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液,立即于580 nm波長下進行比色,記錄吸光度值,利用標準曲線計算相應的淀粉含量,每組作6個平行。按照以下公式得出相對標準偏差和空白加標回收率[9,21-23]。

1.2.6 生麥曲液化力檢測浸提條件單因素實驗 對浸提溶液、料液比、浸提時間、浸提溫度[13-16]和麥曲粉碎度[24]這五個浸提條件進行單因素實驗,考察其對生麥曲液化力檢測結果的影響。

1.2.6.1 浸提溶液的確定 固定料液比1∶200 g/mL、浸提溫度30 ℃、浸提時間1 h、麥曲粉碎度25目,考察不同浸提溶液(0.2 mol/L pH4.60磷酸緩沖液[5,8,25]、稀釋10倍的磷酸緩沖液[11]、1% NaCl溶液[26]、去離子水)對生麥曲液化力的影響。

1.2.6.2 料液比的確定 固定浸提溶液為稀釋10倍的磷酸緩沖液[11]、浸提溫度30 ℃、浸提時間1 h、麥曲粉碎度25目,考察不同料液比(1∶200、1∶150、1∶100、1∶50、1∶10 g/mL)對生麥曲液化力的影響。

1.2.6.3 浸提時間的確定 固定浸提溶液為稀釋10倍的磷酸緩沖液、料液比1∶200 g/mL、浸提溫度30 ℃、麥曲粉碎度25目,考察不同浸提時間(0、0.5、1、1.5、2、2.5 h)對生麥曲液化力的影響。

1.2.6.4 浸提溫度的確定 固定浸提溶液為稀釋10倍的磷酸緩沖液、料液比1∶200 g/mL、浸提時間1 h、麥曲粉碎度25目,考察不同浸提溫度(4、20、30、40、50、60 ℃)對生麥曲液化力的影響。

1.2.6.5 麥曲粉碎度的確定 固定浸提溶液為稀釋10倍的磷酸緩沖液、料液比1∶200 g/mL、浸提時間1 h、浸提溫度40 ℃,考察麥曲粉碎度(不粉碎和10、25、50、100、200目)對生麥曲液化力的影響。

1.2.7 生麥曲液化力檢測方法的應用 分別稱取A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3這12個生麥曲樣品(粉碎度為50目)1.000 g,加入200 mL pH4.60的磷酸緩沖液稀釋10倍,于40 ℃水浴浸提1 h,每隔15 min輕搖混勻,過濾取上清液作為待測酶液。反應液(3個平行):吸取1 g/L的淀粉溶液20 mL和磷酸緩沖液5 mL于比色管中,加入1 mL待測酶液,混勻后準確反應10 min,立即加入200 g/L氫氧化鈉溶液 0.2 mL終止反應;并作空白對照(先加氫氧化鈉溶液滅活,再補加酶液)。分別吸取反應液和空白液1 mL于比色管中,用去離子水稀釋至10 mL,加入1 mL碘-碘化鉀溶液,盡快(15 min內)于580 nm處進行比色,記錄吸光度值,根據標準曲線換算成淀粉濃度,計算反應前后淀粉的減少量。液化力的定義:在30 ℃、pH4.60條件下,1 g絕干麥曲1 h液化1 g淀粉為1個酶活力單位,以U/g表示。在已有文獻[9]的公式基礎上進行修改,其中生麥曲浸出液的稀釋倍數由100改為200,計算公式如下。

其中,X:樣品的液化力(U/g);W0:初始淀粉濃度(g/L);W:反應后淀粉濃度(g/L);10:反應液稀釋倍數;26.2:反應液的體積數;6:由反應中的10 min轉化為每小時;200:生麥曲浸出液的稀釋倍數;1000:體積單位換算系數;A%:麥曲的干質含量(g)。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行顯著性差異分析,利用Excel 2013和Origin 9.3軟件進行數據統計與繪圖。

2 結果與分析

2.1 生麥曲液化力檢測反應條件的確定

2.1.1 淀粉濃度的確定 從表1中可以看出,當淀粉濃度為5、10、20 g/L時,空白液和反應液的吸光度值均高于檢測上限,無法測定生麥曲的液化力。當淀粉濃度為2.5 g/L時,雖然可以檢測到吸光度值,但是2.530和2.375高于吸光度值的合理范圍(0.1～0.8 Abs)[8],測定結果并不準確。當淀粉濃度為1和0.5 g/L時,吸光度值均落在合理區間內,其中淀粉濃度為1 g/L時,空白液和反應液的吸光度差值更大,檢測結果更加準確,可以減小實驗誤差。因此,選擇1 g/L作為生麥曲液化力檢測的淀粉濃度。

表1 不同淀粉濃度下生麥曲液化力檢測的吸光度值Table 1 Absorbance of liquefying power of raw wheat Qu detection under different starch concentrations

2.1.2 反應時間的確定 固定淀粉濃度為1 g/L,從表2中可以看出,在5～20 min內吸光度值均落在合理區間。吸光度差值隨著反應時間增加而增大,尤其是從5～10 min,呈現翻倍增加。由于液化力的定義是每小時的液化能力,因此需要將吸光度差值乘以反應時間轉化系數。計算結果表明,反應時間為10 min時的值最大,為1.848。另一方面,從節約時間的角度考慮,10 min是一個比較合適的反應時間。因此,選擇10 min作為生麥曲液化力檢測的反應時間。

表2 不同反應時間下生麥曲液化力檢測的吸光度值Table 2 Absorbance of liquefying power of raw wheat Qu detection under different reaction times

綜上所知,生麥曲液化力檢測的反應條件為:淀粉濃度1 g/L,反應時間10 min。該結果與沙均響等[9]在檢測白酒大曲液化力時的反應條件一致。

2.2 生麥曲液化力檢測顯色條件的確定

2.2.1 吸收波長的確定 從圖1可以看出,吸光度值隨波長的變化呈現為拋物線形,波長在580 nm前,吸光度隨著波長增加而逐漸增大;波長在580 nm后,吸光度逐漸減小。在最大吸收波長下可以準確地測定物質含量[9,27-29],因此選擇580 nm作為生麥曲液化力檢測的吸收波長。

圖1 吸光度隨波長的變化Fig.1 Changes of absorbance with wavelength

2.2.2 顯色劑添加量的確定 改變碘-碘化鉀溶液的添加體積,碘與淀粉的反應顏色會發生變化[30],所以確定碘液添加量對保證液化力檢測的準確性非常重要。從圖2中可以看出,在碘液添加量小于1 mL前,隨著添加量的增加,吸光度逐漸升高,添加量大于1 mL后,隨著添加量的增加,吸光度呈現降低的趨勢,尤其是碘液添加量為1.4 mL時下降明顯。分析原因是由于碘液與淀粉接觸時,碘分子能進入淀粉分子的螺旋內部,當碘與淀粉的結合達到飽和后,過量的棕色碘液反而會遮蓋碘與淀粉的反應顏色[31],因此選擇1 mL為生麥曲液化力檢測的顯色劑添加量。

圖2 吸光度隨碘液添加量的變化Fig.2 Changes of absorbance with the addition amount of iodine solution

2.2.3 顯色時間的確定 隨著顯色時間的變化,碘與淀粉的反應顏色會隨著顯色時間的推移發生變化[32]。由圖3可知,隨著顯色時間增長吸光度值逐漸降低,這與王榮福等[33]的研究結果一致。從圖中還可以發現,顯色時間在0～15 min內,吸光度值的變化幅度不大,變化率在1%以內。因此選擇15 min內作為生麥曲液化力檢測的顯色時間。

圖3 吸光度隨顯色時間的變化Fig.3 Changes of absorbance with color development time

綜上所知,生麥曲液化力檢測的顯色條件為:顯色波長580 nm,碘-碘化鉀溶液添加量1 mL,顯色后在15 min內完成測定。

2.3 生麥曲液化力檢測

2.3.1 標準曲線的繪制 將淀粉濃度與吸光度值繪制標準曲線,從圖4中可以看出,標準曲線y=13.509x-0.0014具有良好的線性關系,R2值達到0.9998,符合朗伯比爾定律,能很好地滿足后續分析要求。

圖4 淀粉顯色的標準曲線Fig.4 The standard curve of starch color development

2.3.2 生麥曲液化力檢測方法重復性和回收率的測定 選擇三個淀粉濃度,各做6組平行,方法重復性和空白加標回收率的結果如表3所示,在淀粉濃度為0.03、0.05和0.09 g/L條件下,回收率在98.39%～100.60%范圍內,相對標準偏差在2%以內,可見在上述的反應條件和顯色條件下,利用所得的標準曲線可以準確地計算出淀粉濃度[9]。因此,此方法具有良好的可行性和重復性,可以滿足后續實驗的分析要求。

表3 重復性和回收率實驗結果Table 3 Results of repeatability and recovery rate

2.4 生麥曲液化力檢測的浸提條件確定

2.4.1 浸提溶液對液化力的影響 從圖5中可以看出,利用去離子水浸提的液化力最低,而利用其他三種浸提溶液檢測的液化力沒有顯著性差異。其中稀釋10倍的磷酸緩沖溶液既可以穩定麥曲浸提時的pH環境,又可以在大規模檢測樣品時節約緩沖液用量。綜合以上方面的考慮,選擇稀釋10倍的磷酸緩沖溶液作為生麥曲液化力檢測的浸提溶液。

圖5 浸提溶液對生麥曲液化力的影響Fig.5 Effects of extraction solution on liquefyingpower of raw wheat Qu注:A為磷酸緩沖液(pH4.60),B為稀釋10倍的磷酸緩沖液,C為1% NaCl溶液,D為去離子水; 不同的小寫字母代表差異顯著(p<0.05),圖6～圖9同。

2.4.2 料液比對液化力的影響 從圖6中可以看出,料液比對生麥曲液化力的浸出效果影響很大,隨著料液比的增加,液化力呈線性下降,這是因為隨著浸提溶液體積的減少,溶液呈現過飽和狀態,不利于液化力的充分浸出,當料液比為1∶200 g/mL時,液化力的檢測結果最高。但是如果繼續減小料液比,反應液和空白液的吸光度差值過小,測定的精確性降低。因此選擇1∶200 g/mL作為生麥曲液化力檢測的浸提料液比。

圖6 料液比對生麥曲生麥曲液化力的影響Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on liquefyingpower of raw wheat Qu

2.4.3 浸提時間對液化力的影響 從圖7中可以看出,浸提時間在0～1 h內,生麥曲液化力的檢測結果迅速增加,呈現出顯著性差異,1 h之后變化趨于平穩。因此,為了節約實驗時間,選擇1 h作為生麥曲液化力檢測的浸提時間。

圖7 浸提時間對生麥曲液化力的影響Fig.7 Effects of extraction time on liquefyingpower of raw wheat Qu

2.4.4 浸提溫度對液化力的影響 從圖8中可以看出,隨著浸提溫度的增加,生麥曲液化力不斷增大,說明高溫可以提高液化力的浸出效果。但是當溫度大于40 ℃后,提高溫度對液化力沒有顯著性改變。據報道鏈霉菌產生的淀粉酶在溫度高于40 ℃后熱穩定性變弱[34]。此外,黃酒前期釀造過程的溫度為30 ℃,黃酒生產分析檢驗[35]中定義生麥曲液化力檢測的反應溫度為30 ℃,所以浸提溫度為40 ℃更接近該條件。結合節能以及操作便利方面的考慮,選擇40 ℃作為生麥曲液化力檢測的浸提溫度。

圖8 浸提溫度對生麥曲液化力的影響Fig.8 Effects of extraction temperature on liquefyingpower of raw wheat Qu

2.4.5 生麥曲粉碎度對液化力的影響 從圖9中可以看出,隨著生麥曲粉碎度的增加,液化力的測定結果呈現上升趨勢,尤其是粉碎度在10～50目范圍內,生麥曲的液化力迅速上升,呈現出顯著性(p<0.05)差異;粉碎度大于50目后,液化力差異不顯著(p>0.05)。雖然粉碎度大于50目后,液化力仍略有增加,但是考慮到生麥曲粉碎過程中,粉碎度越低,樣品的得率越高,因此選擇50目作為生麥曲液化力檢測的生麥曲粉碎度。

圖9 生麥曲粉碎度對液化力的影響Fig.9 Effects of crushing degree of raw wheat Qu on liquefying power

2.4.6 優化浸提條件對液化力的影響 從表4中可以看出,根據五個浸提條件優化過程中最小值、最大值以及增加率的結果,對生麥曲液化力檢測的影響順序依次為:料液比>浸提溫度>生麥曲粉碎度>浸提時間>浸提溶液,其中料液比和浸提溫度對生麥曲液化力的檢測結果影響很大。與浸提條件優化前的測定結果相比,優化后的生麥曲液化力測定結果提高了19.23%。綜上所述,生麥曲液化力檢測的浸提條件為:浸提溶液為稀釋10倍的磷酸緩沖溶液,料液比為1∶200 g/mL,浸提時間為1 h,浸提溫度為40 ℃,麥曲粉碎度為50目。

表4 浸提條件優化前后生麥曲液化力的變化Table 4 Changes of liquefying power before and after optimization of extraction conditions

2.5 生麥曲液化力檢測的驗證結果

采用有代表性的生麥曲樣品(12個)的液化力來驗證方法的可行性和適用性,檢測結果如表5所示。所有樣品的相對標準偏差在0.50%～5.80%之間,對于麥曲這種復雜且不均一的樣品而言,測定結果的準確性較高。所有樣品的液化力在1.22～3.17 U/g范圍內,數值合理,與毛青鐘等[36-37]、胡衛明等[10]、吳鳴等[38]的液化力檢測結果相近,說明了該方法的合理性。另外測試的生麥曲樣品來自黃酒行業生產規模較大的四家企業,證明了該方法的普適性。

表5 生麥曲液化力的檢測結果Table 5 Results of liquefying power in raw wheat Qu

3 結論

本研究在工業液化酶檢測方法和白酒大曲液化力檢測方法的基礎上,對黃酒生麥曲液化力檢測的反應體系和浸提條件進行了研究,確定反應體系為:淀粉濃度1 g/L,反應時間10 min,顯色波長580 nm,碘-碘化鉀溶液添加量1 mL,顯色后15 min內完成測定,成功地解決了利用工業液化酶檢測方法測定生麥曲液化力時反應顏色過深的問題。其次,對生麥曲液化力檢測的五個浸提條件進行了單因素實驗,確定浸提條件為:浸提溶液為稀釋10倍的pH4.60磷酸緩沖液,料液比1∶200 g/mL,浸提時間1 h,浸提溫度40 ℃,麥曲粉碎度50目,優化浸提條件后生麥曲的液化力提高了19.23%,優化效果明顯。利用此方法檢測了黃酒行業排名前四的工廠生麥曲,12個樣品的液化力在1.22～3.17 U/g,相對標準偏差在0.50%～5.80%,證明了該方法的準確性和適用性。此方法簡單準確,可以快速檢測大批量樣品,為黃酒生麥曲液化力的定量檢測提供了理論指導。