直接競爭ELISA法檢測動物源食品中利巴韋林殘留

劉衛華,沙芳芳,李潤磊,王鑫偉,王向紅,*

(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000; 2.河北省農產品加工工程技術研究中心,河北保定 071000)

利巴韋林(Ribavirin,RBV)為單磷酸次黃嘌呤核苷(IMP)脫氫酶抑制劑,通過抑制IMP阻礙病毒核酸的合成,具有廣譜抗毒效能,用于治療人類丙型肝炎、甲型或乙型流感病毒。長期以來,畜禽養殖中違規使用利巴韋林的使用現象普遍存在。該類藥物易產生耐藥性,禽畜長期大量使用可導致中毒,造成免疫抑制、藥物殘留等多種問題,甚至誘發病毒變異[1],進而嚴重影響禽畜產品質量[2],給人類飲食健康造成隱患和危害。2005年,美國食品藥物管理局(FDA)禁止將人類抗病毒藥物用于畜禽類;我國農業部也發布第560號公告[3],禁止利巴韋林等抗病毒藥物用于畜牧生產。目前,我國已將畜禽產品中是否含有抗病毒類藥物作為日常食品監管、風險監測的重要內容,受到食品檢測機構和風險評估單位的廣泛重視[4]。

目前,對于動物源食品中利巴韋林殘留量的檢測,我國尚未制定或建立國家標準和行業標準,國際上也無相關特定要求。國內外檢測利巴韋林的方法有放射免疫法(RIA)[5-6]、液相色譜法(LC)[7-11]、毛細管電泳法(HPCE)[12-14]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[15-16]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS)[17-21]等理化檢測方法,以及微生物檢測法[22]等方法[23-24]。這些方法研究前期,檢測對象大部分是血液[25]、藥劑[26]和獸藥[27]等。現階段,國內關于液相色譜-串聯質譜法檢測利巴韋林的研究報道比較多,研究對象也轉向腦組織[28]、肝臟[29]、細胞等。上述檢測方法耗時較長,不適用于現場快速篩查,因而有學者研究了以酶聯免疫吸附技術(ELISA)為代表的快速檢測方法[30-33],但這些方法的檢測限(10-3～10-6)相對較高。

本研究針對動物源食品中利巴韋林殘留的風險,采用活潑酯法設計合成利巴韋林完全抗原,制備出相應的特異性抗體,建立直接競爭ELISA(dcELISA)檢測方法,為動物源食品中利巴韋林的檢測提供一種高效、快速的檢測方法和技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

利巴韋林(純度99.9%) 中國藥品生物制品檢定所;鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環己基碳二亞胺(DCC)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水吡啶、琥珀酸酐 均購于美國Sigma公司;Protein A-Sepharose 4B凝膠層析柱 北京市熱景生物技術有限公司；免疫動物雄性新西蘭大耳白兔(10 周齡,1.5-2.0 kg) 河北全友實驗動物養殖場；豬肉、雞肉、豬肝、雞肝 購自保定市場。

UV-2800紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;全波長酶標儀 美國Thermo;垂直電泳儀 北京六一儀器廠;TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RBV完全抗原的合成 采用活潑酯法合成利巴韋林完全抗原[34]。利巴韋林半抗原中間體的合成。稱取1.0 mmol利巴韋林置于20 mL反應瓶中,加入6 mL無水吡啶溶解;再加入10.0 mmol重結晶琥珀酸酐,加熱至沸騰,回流,將反應混合物移至含冰蒸餾水45 mL和濃鹽酸6 mL的混合液中,過濾分離沉淀,干燥12 h備用。

利巴韋林完全抗原的合成，將98.19 mg半抗原、230.18 mg NHS、412.6 mg DCC溶于3140 μL DMF溶液中混勻,20 ℃孵育3 h,緩慢滴加到5 mg/mL KLH/NaHCO3溶液中,4 ℃反應12 h,用PBS透析3 d,分裝,冷凍干燥,-20 ℃保存。

1.2.2 KLH-RBV完全抗原的鑒定 在200～500 nm波長下分別作KLH和KLH-RBV的紫外吸收光譜圖,通過最大吸收峰的差異推斷結合物是否成功合成。

分別做KLH和KLH-RBV的SDS-PAGE凝膠電泳(10%分離膠,5%濃縮膠),根據條帶位置的差異判斷偶聯是否成功。

1.2.3 免疫血清的制備 以KLH-RBV為免疫原,與等量弗氏佐劑充分乳化。采取皮下多點和大腿肌肉的注射方法進行免疫,共進行六輪免疫(首次免疫+5次加強免疫),每次間隔14 d,免疫程序見表1。首次免疫前采集兔子耳緣靜脈血,作為對照血清。第3～6次加強免疫完成后10 d,于兔子耳緣取血,采用間接ELISA法測定其滴度,并考察特異性。于第6次加強免疫后10 d進行心臟取全血,靜置30 min,37 ℃溫育1 h,4 ℃冰箱過夜12 h凝集。第2 d,4 ℃下4000 r/min離心15 min,收集分離出的血清,-20 ℃保存備用。

表1 免疫程序Table 1 The procedure of immunization

1.2.4 抗體的純化 采用ProteinA-Sepharose 4B親和層析法對抗體進行純化。在純化過程中,于280 nm下依次測定每管洗脫液的吸光值,收集洗脫峰吸光度>0.2的洗脫液,用1 mol/L Tris緩沖液進行中和,然后用1×PBS在4 ℃下透析72 h,加入疊氮鈉,-20 ℃保存備用。

抗體濃度計算公式如下:

RBV抗體濃度(mg/mL)=(A1-A0)/1.35×稀釋倍數

其中,A1為利巴韋林抗體在波長280 nm處的吸光度,A0為1×PBS空白對照。

1.2.5 酶標抗原的合成 采用過碘酸鈉法合成酶標抗原(RBV-HRP)。1 mL去離子水置于反應瓶中,加入5 mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解,滴加0.2 mL 0.1 mol/L高碘酸鈉溶液。室溫避光條件下攪拌反應20 min。滴加0.2 mL 0.1 mol/L乙二醇溶液,攪拌反應30 min。用0.001 mol/L pH4.4的醋酸鈉緩沖液,4 ℃透析12 h。

量取1 mL碳酸鹽緩沖液(CBS),加入5 mg利巴韋林標準品充分溶解,緩慢滴入透析溶液。室溫避光下攪拌反應30 min;調整溶液pH為9.5,再攪拌反應1 h。加入0.1 mL 4 mg/mL硼氫化鈉溶液,4 ℃靜置反應2 h。用0.1 mol/L PBS(pH7.4)透析3 d,與等量甘油混合,-20 ℃保存。

1.2.6 直接競爭ELISA法操作步驟 包被:用CBS(0.05 mol/L,pH=9.6)稀釋抗體濃度為10 μg/mL,100 μL/孔,4 ℃包被過夜12 h；封閉:加5% BSA,200 μL/孔,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次；加樣:將利巴韋林標準品用PBS(1×)倍比稀釋1000、100、10、1、0.1、0.01 μg/L不同濃度梯度,50 μL/孔,再加入酶標抗原,50 μL/孔,設空白和陰性對照(不加酶標抗原),37 ℃孵育1 h,PBST洗板5次；顯色:加入底物液(14.6 mL底物液A 與0.45 mL底物液B混合而成),150 μL/孔；終止:加入1.25 mol/L濃硫酸溶液,50 μL/孔；測定:用酶標儀在450 nm下測定OD值。

1.2.7 直接競爭 ELISA 反應體系條件的優化

1.2.7.1 RBV抗體與酶標抗原工作濃度的確定 采用方陣實驗法[35],將抗體和酶標抗原分別稀釋,抗體濃度稀釋為16、14、12、10、8、6、4、0 mg/L,100 μL/孔包被,4 ℃保持12 h;洗板后37 ℃封閉1 h,酶標抗原作800、400、200、100、50、0 倍稀釋后加入酶標板中。其余步驟同1.2.6。選擇OD值為1.0 左右的條件作為抗體與酶標抗原的最佳工作濃度。

1.2.7.2 封閉液濃度的優化 將RBV抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過夜12 h;以不同濃度(0%、2.5%、5%、10%)的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進行封閉,其余步驟同1.2.6。選擇OD為1.0左右、靈敏度高的封閉液濃度作為最佳條件。

1.2.7.3 離子強度的優化 采用雙蒸水、1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS、5×PBS,分別稀釋利巴韋林標準品進行試驗,步驟同1.2.6。

1.2.7.4 最優pH的確定 用4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5等6個不同pH的碳酸鹽緩沖液(CBS),分別稀釋利巴韋林抗體進行試驗,步驟同1.2.6。

1.2.7.5 標準曲線的繪制 在優化的最佳工作條件下,將RBV標準品稀釋為10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,采用直接競爭ELISA法,以RBV濃度的對數為橫坐標,抑制率為縱坐標,繪制標準曲線,并確定其靈敏度(IC50)、最低檢測限(IC15)以及線性檢測范圍。抑制率計算公式如下:

抑制率(IC,%)=[1-(OD樣品-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100

1.2.8 樣品檢測

1.2.8.1 樣品前處理 取雞肉、雞肝、豬肉、豬肝作為檢測樣品。樣品攪碎,取2.0 g,加入6 mL復合提取液(甲醇/水,8∶2),室溫超聲(500 W)提取5 min,靜置10 min,4000 r/min 4 ℃離心5 min。對于肌肉樣品,取1 mL上清液,加入30 μL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻;對于內臟樣品,取1 mL上清液,加入20 μL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻。

1.2.8.2 樣品加標回收率的測定 雞肉、雞肝、豬肉稀釋80倍、豬肝稀釋40倍,能夠消除基質影響,故將雞肉、雞肝、豬肉加標量設為豬肝中加標量的2倍,以保證稀釋后實際檢測濃度相同。向空白豬肉、雞肉、雞肝中分別添加400、800、1600 μg/kg RVB標準品,豬肝樣品中添加200、400、800 μg/kg的利巴韋林標準品,按照1.2.8.1方法進行樣品處理,按照1.2.6直接競爭ELISA法操作步驟測定樣品中RBV濃度,每個樣品設3個重復,計算回收率。

1.2.9 高效液相色譜法驗證 HPLC色譜分析條件:Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流速0.6 mL/min;流動相:乙酸銨/乙腈(95∶5,V/V);進樣量:10 μL;紫外檢測器。

1.2.9.1 樣品的前處理 稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 1%三氯乙酸溶液-乙腈溶液(1∶1)漩渦混勻,超聲(500 W)提取30 min,8000 r/min 4 ℃離心10 min,加入10 mL正己烷,8000 r/min 4 ℃離心,棄去正己烷層。將全部上清液加載至依次用3 mL甲醇、4 mL 0.1%甲酸溶液活化過的SCX柱中,依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗柱子,5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液,用氮氣吹干,1 mL流動相溶液溶解、定容。過0.22 μm有機濾膜,濾液供HPLC分析。

1.2.9.2 添加回收率的測定 向空白豬肉、雞肉、雞肝中分別添加400、800、1600 μg/kg的利巴韋林標準品,豬肝樣品中添加200、400、800 μg/kg的利巴韋林標準品,按照1.2.9.1方法處理,采用HPLC法測定樣品中的抗體濃度,每個樣品設3個重復,計算回收率。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 RBV完全抗原的鑒定

圖1為KLH、RBV、KLH-RBV的紫外掃描光譜圖。由圖1可知,利巴韋林與載體KLH發生偶聯反應后,其產物KLH-RBV的紫外吸收曲線與載體蛋白KLH相比,最大吸收峰的位置發生了改變,因此初步判定KLH上已經成功連接上了一定數量的利巴韋林[36]。通過SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定(圖2),KLH-RBV多個條帶的遷移率小于KLH,說明KLH-RBV的分子量大于KLH,KLH-RBV人工抗原成功合成[37-38]。

圖1 KLH,RBV,KLH-RBV紫外掃描光譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of KLH, RBV and KLH-RBV

圖2 SDS-PAGE法鑒定KLH-RBV和KLHFig.2 Identification chart of KLH-RBV and KLH by SDS-PAGE注:1:KLH;2:KLH-RBV。

2.2 抗體純化及效果鑒定

2.2.1 抗體純化 在純化過程中,用紫外-可見分光光度計連續測定不同管數下,經過純化抗體的吸光度,繪制抗體純化曲線(見圖3)。根據公式計算,得出純化后利巴韋林的最大濃度為0.93 mg/mL。

圖3 抗體純化曲線Fig.3 The purification curve of antibody

2.2.2 紫外分光光度法鑒定抗體純化效果 由圖4可知,未經純化的抗血清有較多雜峰,表明血清中成分不純;純化后的血清只有兩個吸收峰,其中一個在280 nm處,為抗體蛋白標志峰[39],波峰明顯。因此,可以判定抗血清經純化后,去掉了雜質,獲得了較純的免疫球蛋白。

圖4 抗體血清純化前后紫外掃描圖Fig.4 UV spectrum of antiserum before and after purification

2.3 直接ELISA反應體系條件的優化

2.3.1 RBV抗體與酶標抗原最佳工作濃度的確定 試驗結果見表2。選擇OD值為1.0左右的抗體包被濃度與酶標抗原稀釋度為最佳濃度。由表2可知,當OD值等于1.018時,最接近1.0,選擇此時的包被抗體濃度為10 μg/mL,酶標抗原稀釋400倍,為最佳工作濃度。

2.3.2 封閉液濃度的優化 由圖5可知,當封閉液濃度為5%時,OD值最接近1.0,而此濃度下的IC50較小。因此,封閉液的最佳濃度為5%。

圖5 封閉液濃度的優化Fig.5 Optimization of blocking solution concentration

2.3.3 離子強度的優化 由圖6可知,當選取1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS時,最大OD值均接近1.0;其中,選取1×PBS時,IC50值最小。綜合比較,選取1×PBS作為最佳離子強度。

圖6 離子濃度的優化Fig.6 Optimization of ionic concentration

2.3.4 最佳pH的確定 由圖7可知,當pH為7.5和8.5時,最大OD值接近1.0;其中,pH為7.5時,IC50值最小。綜合比較,選擇pH7.5作為最優pH。

圖7 pH的優化Fig.7 Optimization of pH

2.4 直接競爭ELISA檢測方法的建立

在最優試驗條件基礎上,建立利巴韋林檢測的標準工作曲線(線性范圍0.0001～10000 ng/mL),見圖8。擬合方程為y=4.1357ln(x)+40.107,R2=0.9973。

圖8 RBV標準曲線Fig.8 Standard curve of RBV

經計算,IC50是10.84 ng/mL,靈敏度比較高;最低檢測限(IC15)為0.002 ng/mL。

2.5 樣品加標回收率

表3是樣品加標回收試驗結果。由表3可知,雞肉、雞肝、豬肉、豬肝的加標回收試驗中,回收率在 80.23%～90.07%,實際檢測濃度與添加濃度接近。

表3 dcELISA法測定樣品中利巴韋林加標回收率(n=3)Table 3 Recovery rate of RBV in samples by dcELISA(n=3)

2.6 高效液相色譜法驗證

采用高效液相色譜法對dcELISA法檢測結果進行驗證。雞肉、雞肝、豬肉和豬肝4種樣品的加標回收率如表4所示,回收率在83.73%～95.48%。

表4 HPLC法測定樣品中利巴韋林加標回收率(n=3)Table 4 Recovery rate of RBV in samples by HPLC(n=3)

對直接競爭ELISA法與HPLC法的測定結果進行線性回歸分析,擬合曲線見圖9,擬合方程為y=0.9812x+3.3642,R2=0.9957。由圖9可以看出,HPLC法測定的樣品添加濃度值和ELISA法測定的樣品添加濃度值呈現良好的線性關系,說明本試驗所建立的ELISA法準確、可靠。

圖9 ELISA 和HPLC測定結果擬合曲線Fig.9 The fitting curve of ELISA and HPLC

3 結論

本研究針對動物源食品中利巴韋林的殘留,采用活潑酯法將利巴韋林(RBV)與鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯制備利巴韋林完全抗原(KLH-RBV),通過免疫動物得到多抗血清,純化后得到抗體,并在此基礎上建立了直接競爭酶聯免疫吸附檢測方法。在0.0001～10000 ng/mL范圍內,該檢測方法的IC50為10.84 ng/mL,最低檢測限達0.002 ng/mL;樣品加標回收率在80.23%～90.07%之間。經驗證,此方法與高效液相色譜法的測定結果具有良好的線性關系(R2≥0.99)。所建立的方法靈敏度較高,可用于動物源食品中利巴韋林殘留的大批量、快速檢測。