基于PriME凈化的高效液相色譜串聯質譜法檢測水產品中9種生物胺

葉磊海,裘均陶,鐘世歡,趙紅波,王慶玲,葉佳明,詹越城,楊 娜

(1.浙江公正檢驗中心有限公司,浙江杭州 310009; 2.贊宇科技集團股份有限公司,浙江杭州 310009)

生物胺(BAs)是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱,廣泛存在于富含氨基酸和蛋白質的水產品中,主要包括組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、章魚胺等。生物胺是人體內正常的活性成分,維持著內臟功能和免疫系統的代謝活動,在生物活性細胞中發揮著重要作用[1],適量的生物胺對人體有益,但過量的生物胺會對人體產生毒害作用。事實上,由生物胺導致的中毒事件時有發生,2010年,張家港市員工因食用不清潔青占魚導致集體食物中毒;2013年,深圳市某食堂因進食不潔鮐魚引發食物中毒,調查結果均證實不是由致病菌引起的,而是由變質魚肉中所含的高含量組胺引起的。水產品的生物胺主要是在微生物作用下,游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基形成的產物,其中以組胺、酪胺毒性最大,目前已把生物胺含量作為評價水產品新鮮度的重要指標。

目前,國內外檢測生物胺類物質的方法主要有薄層色譜法[2]、免疫分析法[3]、氣相色譜法[4]、離子色譜法[5]、高效液相色譜法[6-10]和液相色譜質譜串聯法[11-14]。其中高效液相色譜法是目前檢測此類物質最廣泛的方法,但是由于生物胺極性很強,在C18柱上保留很弱,且大部分物質在可見和紫外波長范圍內無明顯吸收,也無熒光成分[15],需要通過柱前或柱后衍生,前處理步驟繁瑣,整個檢測周期長,且衍生物不穩定,衍生后的圖譜雜質較多,給目標物的定性和定量檢測帶來很大的難度。

本研究擬運用高效液相色譜-串聯質譜法,通過優化提取和凈化方法以及色譜和質譜條件,對不同水產品的生物胺進行了分析測定,并嘗試通過放置溫度和放置時間來分析影響水產品的主要生物胺指標,建立同時檢測9種生物胺的快速檢驗方法,以期為此類物質的檢測提供更多的技術選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品:南美白對蝦、梭子蟹、大黃魚、甲魚、鯽魚等 農貿市場抽取;組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、章魚胺 純度≥98.0%,德國Dr.Ehrenstorfer;乙腈、甲酸、甲酸銨 色譜純，美國J.T.Baker;鹽酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

4500液相色譜串聯三重四級桿質譜儀 美國AB公司;SOP萬分之一電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司;Supelco 24管固相萃取裝置 美國Supelco公司;固相萃取小柱 6cc/200 mg Oasis MAX、HLB、PriME HLB 美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取25.0 mg上述標準品于25.0 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶解,定容配制成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液,于4 ℃避光保存。分別量取1.0 mL,于100 mL容量瓶中,用定溶液定容至刻度,配制成濃度為10 μg/mL混合標準溶液,實驗中根據需要配制標準工作液。

1.2.2 樣品前處理 稱取1.0 g混合均勻的樣品于50.0 mL離心管中,加入酸化乙腈8 mL,超聲提取10 min,10000 r/min離心5 min,用酸化乙腈8 mL重復提取殘渣1次,合并提取液并定容至20 mL,取上清液5 mL轉入PriME HLB固相萃取柱中(無需對PriME HLB進行活化),以1 滴/s的速度過柱,收集全部流出液后,在45 ℃下用氮氣吹至近干,并用乙腈-20 mmol/L甲酸銨溶液(用甲酸調至pH4.0,8∶2,V/V)定容溶液定容至1 mL,混勻過0.22 μm濾膜上機。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為WATERS HILIC柱(2.1 mm×50 mm,1.7(m),流動相:A:20 mmol/L甲酸銨(甲酸調pH為4.0),B:CH3CN,梯度洗脫程序:0～2 min,90%～80% B%,2～5 min,80%～75% B%,5～6 min,75%～40% B%,6～9 min,40%～40% B%,9～12 min,40%～90% B%。

流速:0.3 mL/min,溫度:30 ℃,進樣量:5 μL。

1.2.4 質譜條件 掃描方式采用電噴霧正離子掃描(ESI+);多反應監測(MRM);噴霧壓力50 psi;干燥氣流速10 L/min;干燥氣溫度550 ℃;毛細管電壓4500 V。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取劑的選擇 由于水產品中基質復雜,含有較高濃度的蛋白質和內源性物質,干擾目標物的分析,在選擇提取溶液時必須能使蛋白質變性沉淀,減少基質影響。崔曉美等[13]選取乙腈-甲酸銨水溶液為提取劑,利用腈基固相萃取填料測定鰹魚中5種生物胺的含量,孫亞軍等[16]利用1%三氯乙酸做提取劑,來測定蝦仁中8種的生物胺等。結合文獻一般以鹽酸、高氯酸、三氯乙酸、乙腈或乙酸乙酯等溶劑為提取劑,考慮到強酸溶液如果沒有完全凈化,并且進行大批量樣品處理后進入質譜會腐蝕儀器,再加上后續固相萃取柱的選擇,本實驗選擇考察乙腈、0.2%酸化乙腈和乙酸乙酯的提取效果。

本實驗分別考察了乙腈、0.2%酸化乙腈、乙腈-乙酸乙酯(1∶1)提取效率,結果如圖1所示。由圖1可知,分別用南美白對蝦、梭子蟹和大黃魚作為基質,0.2%酸化乙腈作為提取劑時回收率達到90%以上,均高于乙腈和乙腈-乙酸乙酯(1∶1),因而本實驗選擇0.2%酸化乙腈作為提取溶劑。實驗還發現,用乙酸乙酯作為共萃劑時,雜質較多,增加了后續凈化的難度,有乙腈存在的體系,雜質較少,提取物干凈,主要是由于乙腈有更好沉淀蛋白的效果。

圖1 不同提取劑回收率比較Fig.1 Comparison of recovery rates of different extraction agents

2.1.2 萃取柱的選擇 本實驗采用Prime HLB萃取小柱進行樣品的凈化。本文對MAX、HLB以及PriME HLB固相萃取柱的保留效果進行了比較。結果發現,用MAX有比較好的凈化和吸附能力,但是基質效應比較嚴重,離子抑制效應較強;在普通HLB中很難保留,采用PriME HLB,可用酸化乙腈的提取液過柱,目標物化合物通過小柱,水產品中磷脂、色素、脂肪等雜質被吸附于萃取柱,這樣既能使干擾物有效去除,又確保了待測組分無損失,同時在凈化過程中省去了溶劑轉換的過程,簡化了操作步驟。同時比較了不同基質中3種萃取小柱的回收率,發現在普通HLB中回收率最低,MAX回收率次之,在Prime HLB中回收率達到90%以上。通過比較,無論是實際凈化步驟的復雜程度,還是保留效果和回收率,PriME HLB都優于其他兩種柱子。

2.2 色譜條件的優化

生物胺極性較強,在反相色譜柱中幾乎無保留,本研究嘗試選擇反相C18柱進行分離檢測,實驗發現大部分目標物在色譜柱上沒有保留,出峰時間小于1 min,通過調節流動相組成和比例也沒有明顯改善,而 HILIC(親水作用色譜)固定相為硅膠,用于保留和分離強極性的堿性化合物,因此選擇HILIC色譜柱進行生物胺的分離。

HILIC常用來分析正離子的流動相主要是甲酸-乙腈或甲酸銨-乙腈,通過比較,以甲酸-乙腈為配比的流動相時,各目標物出峰較早,分離效果不佳,而加入甲酸銨改性劑后能顯著增加目標物在柱子上的保留,提高目標物的響應,所以選擇甲酸銨-乙腈作為流動相。

進一步考察了5、10、20 mmol/L不同濃度的甲酸銨溶液作為流動相時各目標物的分離情況,結果發現采用乙腈-甲酸銨溶液(含20 mmol/L酸銨,調pH為4.0)作為流動相進行梯度洗脫可以兼顧9種生物胺色譜保留行為及質譜響應,經優化后的梯度洗脫能有效分離9種化合物。

2.3 質譜條件的優化

質譜條件的優化用直接接二通方式進行,用0.1 mL/min的流速將生物胺注入電噴霧離子源,根據總離子流響應值和分子離子峰響應值的強度確定最佳質譜參數,主要對去簇電壓及碰撞能進行優化,以去簇電壓和碰撞能為例,去簇電壓過小,會檢測不到信號,降低靈敏度,電壓過大會導致源內裂解,同樣降低分子離子峰的豐度,而碰撞能的大小直接決定著能否獲得較高響應的子離子,本實驗首先對目標物進行一級質譜分析(Q1掃描),得到母離子質量數,優化去簇電壓,保證母離子的傳輸效率;對母離子碰撞后,進行二級質譜分析(Q3掃描),得到子離子質譜圖,優化碰撞能,然后在多反應監測(MRM)模式下使用優化好的去簇電壓和碰撞能進行測試,此外進一步優化毛細管電壓,霧化器壓力,干燥器溫度和流速等質譜參數使離子化效率達到最佳,9種目標物都形成[M+H]+分子離子,并在二級質譜中,產生兩個較為穩定的子離子。具體參數見表1,MRM色譜圖見圖2。

表1 9種生物胺多反應監測掃描模式的質譜參數Table 1 Parameters of MS/MS for the 9 biomamine amines(BAs)MRM mode

圖2 不同基質中3種固相萃取柱生物胺回收率的比較Fig.2 Comparison of recovery rates of bioamines from 3 kinds of solid phase extraction columns in different substrates

圖3 9種生物胺對應的定量離子和定性離子MRM色譜圖Fig.3 Quantitative and qualitative MRM chromatograms of 9 biogenic amines

2.4 線性關系和檢出限的考察

在本文所確定的色譜和質譜條件下,對9種生物胺進行測定,用魚肉空白基質配制一系列濃度為1～200 ng/mL,以質量濃度為橫坐標,定量離子對峰面積為縱坐標建立標準曲線,通過向陰性樣品中添加目標物來考察方法的檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10),線性回歸方程、線性關系,具體見表2。通過表2可以看到目標物在此線性范圍內相關系數r≥0.999,線性相關良好,由于生物胺在液質中響應較高,且靈敏度不同,考慮到實際樣品中的含量,規定了如表2所見的線性范圍(1～200 ng/mL),檢出限(5 μg/kg)和定量限(15 μg/kg),能完全滿足實際樣品的測定。

表2 9種生物胺的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)Table 2 Linear equations,coefficient of correlation,linear ranges,detection limit (LOD)and quantitative limit(LOQ)for the 9 biological amine

2.5 方法回收率和精密度驗證

選取水產品中南美白對蝦、梭子蟹、大黃魚、甲魚、鯽魚不同基質陰性樣品分別添加15、30、50 μg/kg 3個不同濃度,每個濃度進行6次重復測定,考察方法回收率和精密度,從結果來看,該方法回收率在不同基質中達到80.5%～109.5%之間,相對標準偏差(RSD)為2.3%～5.9%,本方法具有較高的精密度和準確度,其中養殖大黃魚中的加標回收實驗結果具體見表3,其他數據不一一列出。

表3 基質中9種生物胺加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 9 biogenic amine in blank matrix

2.6 實際樣品的測定結果

選取了市售的水產品中蝦、魚及甲魚共10份,在20、35 ℃下分別放置1、9 d進行9種生物胺含量測定,在20 ℃環境下放置1 d,有2 mg/kg左右濃度的組胺、酪胺、精胺、亞精胺和章魚胺的檢出,9 d后測定濃度增加不大,而在35 ℃環境下放置9 d,生物胺濃度迅速積累,新鮮程度劇烈下降,肉質腐敗,其中組胺、尸胺、腐胺濃度最高,達到800～5000 mg/kg,苯乙胺、酪胺和章魚胺濃度達到100～300 mg/kg,亞精胺和精胺濃度變化不大,說明溫度對水產品組織中產生的生物胺有著重要的影響,也說明組胺、尸胺、腐胺可以作為評判水產品新鮮程度的主要指標。

3 結論

本文建立了高效液相色譜串聯質譜法同時測定水產品中9種生物胺含量的檢測方法,以0.2%甲酸乙腈為提取劑,用PriME HLB固相萃取柱凈化,通過HILIC色譜柱進行分離,在正離子多反應監測模式下進行定量分析。結果顯示,9種生物胺在12 min內得到分離,相關系數均達到0.999以上,方法檢出限為5 μg/kg,定量限為15 μg/kg,平均回收率在80.5%～109.5%之間,相對標準偏差(RSD)在2.3%～5.9%之間。說明該方法方法操作簡單,回收率高,重現性好,能夠準確定性和定量低濃度生物胺,并且無須衍生,彌補了高效液相色譜法的不足,為進一步準確評價水產品中的生物胺含量提供了豐富的技術手段。應用本實驗確定的方法對在20、35 ℃下分別放置1、9 d實際樣品進行測定,發現組胺、尸胺、腐胺含量隨著時間和溫度的變化顯著增加,說明儲藏溫度和儲藏時間是影響生物胺在水產品中產生的重要條件,這也為進一步評價水產品的新鮮程度提供了理論依據。