MiR-29b inhibitor基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的實驗研究

馬鋼 ，肖云峰 ，劉曉民 ，丁良甲 ，劉長路 ，高博

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010100

關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床十分常見，可由外傷、手術(shù)、感染和退變等引起。關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力有限[1]，損傷繼發(fā)退變，最終引起疼痛、關(guān)節(jié)活動受限等一系列臨床癥狀。目前修復(fù)軟骨損傷常用的治療方法能夠取得一定療效，但長期表現(xiàn)不盡如人意。microRNA-29b（miR-29b）家族在調(diào)控BMSCs成骨分化過程中具有正性調(diào)節(jié)作用[2]，miR-29b對BMSCs來源的軟骨細(xì)胞的肥大化進(jìn)程具有重要的正性調(diào)控作用。所以我們推斷，抑制通過miR-29b調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大化的進(jìn)程，可能會延緩組織工程軟骨的衰退和鈣化。2017年1月—2018年1月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)選用新西蘭大白兔2只，研究miR-29b inhibitor基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成軟骨分化的潛能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔2只，雌性不限，體重2.6 kg左右，均由內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要材料、試劑和設(shè)備

兔 BMSCs 分 離 液 1.090；CD34、CD44、CD45、CD105抗兔單克隆抗體；DMEM/F12培養(yǎng)基、LDMEM培養(yǎng)基；miR-29b inhibitor過表達(dá)慢病毒；鼠抗兔I型膠原單克隆抗體；鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體；SABC二抗試劑盒。臺式離心機(jī)，恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡（1×70），流式細(xì)胞儀。

1.3 方法

首先做兔BMSCs的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定，其次做慢病毒的miR-29b inhibitor質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染，然后做BMSCs分別向成骨及成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及檢測。

實驗分為實驗組A、實驗組B和對照組予以不同的處理，實驗組A：miR-29b inhibitor基因修飾的BMSCs分別進(jìn)行成骨及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)；實驗組B：P3代BMSCs分別進(jìn)行成骨及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)；對照組：P3代BMSCs采用10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長及增殖情況。成骨培養(yǎng)后進(jìn)行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、I型膠原免疫組化染色，成軟骨培養(yǎng)后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、番紅O、Ⅱ型膠原免疫組化染色。所有計數(shù)陽性細(xì)胞率的方法均為隨機(jī)計數(shù)3張玻片，每片200倍鏡下隨機(jī)取2個視野，采用網(wǎng)格計數(shù)法計算陽性細(xì)胞的百分比。

1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用Welch’s anova檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

BMSCs體外向成骨及成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及檢測。

2.1 成骨誘導(dǎo)分化

堿性磷酸酶染色：實驗組A、實驗組B與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組A與實驗組B比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組不同時間點堿性磷酸酶染色（±s）

表1 各組不同時間點堿性磷酸酶染色（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與實驗組 B 比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天實驗組A實驗組B對照組F值P值（12.50±2.07）1）2）（49.67±3.44）1）0.67±0.82 577.42 0.000（44.51±4.08）1）2）（75.52±6.28）1）6.51±2.07 434.02 0.000

茜素紅染色：實驗組A：表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特性，但較實驗組B緩慢。實驗組B：14 d后表現(xiàn)出明顯的成骨細(xì)胞特性。對照組：未見明顯細(xì)胞團(tuán)塊，未見鈣化結(jié)節(jié)。

Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色：實驗組A、實驗組B與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組A與實驗組B比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組不同時間點Ⅰ型膠原免疫組化染色（±s）

表2 各組不同時間點Ⅰ型膠原免疫組化染色（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）；2）與實驗組 B 比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天實驗組A實驗組B對照組F值P值（6.02±1.67）1）2）（32.01±8.09）1）0.33±0.52 69.33 0.000（36.51±3.15）1）2）（64.51±5.21）1）6.51±1.05 522.43 0.000

2.2 成軟骨誘導(dǎo)分化

顯微鏡下：實驗組A與B組無明顯差別；甲苯胺藍(lán)染色：實驗組A與實驗組B相似；對照組14 d時可見胞漿異染弱陽性。

番紅O染色：實驗組A與實驗組B相似，對照組14 d時可見胞漿異染弱陽性。

Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色：實驗組A與實驗組B相似，實驗組A、實驗組B與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3，實驗組 A與實驗組B比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組不同時間點Ⅱ型膠原免疫組化染色（±s）

表3 各組不同時間點Ⅱ型膠原免疫組化染色（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

組別 時間（第7天） 時間（第14天）實驗組A實驗組B對照組F值P值（7.33±2.16）1）（6.83±1.94）1）0.33±0.52 53.02 0.000（26.51±3.15）1）（27.33±2.80）1）0.51±0.55 193.27 0.000

3 討論

該次研究結(jié)果顯示Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗組 A：（6.02±1.67）、實驗組 B：（32.01±8.09）與對照組（0.33±0.52）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組A與實驗組B比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明 miR-29b inhibitor基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力較P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞弱 （P＜0.05）；Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗組A （7.33±2.161）、實驗組 B（6.83±1.94）與對照組（0.67±0.82）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組A與實驗組B比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示成軟骨分化能力兩者相似。BMSCs具有多向分化潛能，在不同的環(huán)境中可以向各自不同的方向進(jìn)行分化[3]。而骨軟骨組織工程的目的就是將BMSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，使其成為所需的成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。目前研究的目的基因主要有刺激軟骨增殖分化和基質(zhì)形成、抑制軟骨細(xì)胞肥大和成骨分化、抗炎性反應(yīng)、抑制衰老和抑制凋亡等。但是，大多數(shù)基因轉(zhuǎn)染方法都是以促進(jìn)軟骨組織修復(fù)為目的，提供促進(jìn)蛋白合成類因子的基因，忽略了抑制軟骨肥125-大和成骨化等基因的調(diào)節(jié)作用，因此長期表現(xiàn)都不盡如人意。microRNA廣泛存在于自然界中，是一種大小約為22nt的內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA，是調(diào)控BMSCs成骨分化的正調(diào)控基因，并且影響B(tài)MSCs成軟骨分化過程，使之向肥大化軟骨細(xì)胞分化，在胚胎發(fā)育及細(xì)胞增殖分化和凋亡等多種生命活動中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。

在該實驗中，miR-29b inhibitor基因修飾的BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)成骨分化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞可貼壁，并逐漸形成集落層疊狀，然后形成細(xì)胞團(tuán)塊或結(jié)節(jié)狀，分泌骨基質(zhì)并最終形成礦化結(jié)節(jié)。進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色、Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞ALP染色可見細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒；茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成；Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，細(xì)胞被染成黃褐色，但較P3代BMSCs表現(xiàn)出較弱的成骨特性。推斷miR-29b inhibitor雖然影響B(tài)MSCs的成骨誘導(dǎo)，但可能因miR-29b inhibitor持續(xù)分泌不足或條件培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)作用強(qiáng)于miR-29b inhibitor的作用，最終仍表現(xiàn)出成骨細(xì)胞生物學(xué)特性，向成骨細(xì)胞分化。而經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后，P3代BMSCs和miR-29b inhibitor基因修飾的BMSCs甲苯胺藍(lán)染色均可見細(xì)胞內(nèi)、外的物質(zhì)均被染成紫紅色，說明細(xì)胞合成分泌酸性的糖胺多糖；番紅O染色可見細(xì)胞聚集部位被染成紅色，表明局部合成和分泌糖胺多糖；Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，細(xì)胞被染成棕褐色，進(jìn)一步證實細(xì)胞表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，向軟骨細(xì)胞分化。在苗瑩[7]等的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)BMSCs向肥大化的軟骨細(xì)胞分化過程中，miR－29b表達(dá)量呈漸增狀態(tài)，表明miR－29可能是軟骨細(xì)胞肥大化的正性調(diào)節(jié)因子。而miR－29b表達(dá)上調(diào)對軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程有促進(jìn)作用，而抑制其表達(dá)時在肥大化階段的第21天后，ColII表達(dá)明顯上升而ColX表達(dá)明顯降低，提示抑制miR-29表達(dá)后會阻礙軟骨細(xì)胞肥大化，這一結(jié)果與此次研究的結(jié)果相一致。

該次研究表明，在干細(xì)胞成骨分化的過程中，miR-29b的表達(dá)上調(diào)可能對組蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase，HDAC4）進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響B(tài)MSCs成軟骨細(xì)胞分化的過程。而軟骨肥大化過程與轉(zhuǎn)錄因子 Sox9和Runx2密切相關(guān)。HDAC4通過和Runx2結(jié)合，抑制 Runx2和DNA的結(jié)合，進(jìn)一步影響Sox9-Runx2平衡，從而調(diào)節(jié)軟骨肥大化進(jìn)程。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)miR-29b表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大化進(jìn)程，通過抑制miR-29b的表達(dá)，可推遲軟骨細(xì)胞的肥大化進(jìn)程。所以，該實驗中，通過miR-29b inhibitor的抑制作用，抑制BMSCs中的miR-29b的表達(dá)，可能通miR-29b/HDAC4/Sox9-Runx2信號通路，在調(diào)控BMSCs成骨誘導(dǎo)的同時，也推遲BMSCs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程，為組織工程骨軟骨修復(fù)缺損提供一種新的探索。

4 結(jié)論

miR-29b inhibitor基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)劑作用下具有向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的潛能，為組織工程中關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨損傷的修復(fù)提供新思路。