肌酐檢測方法學評價及其研究進展

譚紅軍 ，羅春華 ，楊林 ，董貞榮 ，張玉紅 ，張新明 ，汪彬彬

1.湖北三峽職業技術學院醫學院，湖北宜昌 443000；2.三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌 443003；3.湖北三峽職業技術學院附屬醫院，湖北宜昌 443000

肌酐 （Creatinine，Cr）是水溶性的有機含氮化合物，分子式為C4H7ON3，分子量為113.1188，又稱2-氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮，甲基胍基乙酸內酰胺。血中肌酐是肌肉組織中磷酸肌酸和肌酸通過非酶促、不可逆的脫磷酸反應生成的代謝終產物，少部分由肉類食物代謝產生，肌酐由腎臟排出。與尿素相比，肌酐從腎小球濾過后不被腎小管重吸收，受飲食因素影響也更小，因此血Cr和內生肌酐清除率Ccr更能準確反映腎小球濾過率（GFR）即腎臟的排泄功能。美國腎臟基金會腎臟病預后質量倡議（K/DOQI）專家組和我國均將GFR作為慢性腎臟病 （CKD）診斷與分期的依據，且均推薦根據血清Cr計算Ccr以評估GFR。全世界有超過5億人患有不同程度的慢性腎臟病，發病率位居前10，我國CKD的發病率為10%～13%，所以準確檢測Cr對CKD診斷與分期具有重要意義。Cr檢測方法至今已報道過10余種，以下從肌酐檢測方法學層面進行評述。

1 檢測方法與評價

1.1 Jaffe反應

Jaffe反應法是檢測肌酐的經典方法，1886年Jaffe發現在堿性環境中，肌酐和苦味酸反應生成橘紅色的苦味酸肌酐（Janovski）復合物，在500～520 nm處檢測，Greenwald經系統研究后認為是肌酐與苦味酸形成絡合物所至。由于基質效應，血清存在不少的假肌酐，使檢測結果偏高，如肌酐同系物乙內酰脲、及乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白質、頭孢菌類抗生素等；而膽紅素、維生素C、血紅蛋白等可使結果偏低。假肌酐屬于非特異性范疇，膽紅素、維生素C、血紅蛋白則屬于干擾，假肌酐約60%存在于紅細胞中，約20%存在于血漿或血清，約5%存在于尿液，因此測定血液肌酐時最好用血清或血漿且不溶血。Nah等[1]證實膽紅素負干擾Jaffe法當血Cr＜53 μmol/L時與膽紅素濃度相關，Cr53～97.2 μmol/L時膽紅素干擾顯著，而酶法則顯示無此干擾。Jaffe's法延用至今100多年，特異性不高以及干擾問題是其方法學的固有屬性，為此Jaffe法經過了不斷改良。

1.1.1 終點法從全血到血清，進行不去蛋白和去蛋白檢測。利用鎢酸溶液離心去蛋白終點法，回收率受無蛋白濾液pH影響，pH在3～4.5時為85%～90%，pH小于2時為100%，線性范圍1320 umol/L。為減少非特異性反應，還采用過①利用白陶土、Fuller’s土、硅酸鋁土或皂土吸附無蛋白濾液中的Cr，②利用陽離子交換樹脂吸附無蛋白濾液中的Cr，再洗脫測定。這些方法樣品處理繁瑣，不適于自動儀器上進行批量樣本測定。

1.1.2 二點（速率）法 根據肌酐、假肌酐與苦味酸形成絡合物的速度不同，即快反應假肌酐物質如乙酰乙酸在20 s內完成反應，慢反應假肌酐物質（其它多數假肌酐）在80 s后才發生呈色反應，在此兩個時間段內Cr與苦味酸顯色反應占絕對優勢，故選擇20～80 s“窗口期”的反應速率來計算真肌酐的含量（不同于酶活性濃度速率法測定，肌酐的二點法是與校準液同步測定的）。回收率96.7%～100.4%，平均98.5%，線性范圍1 768 μmol/L，CV5%。該方法成本低廉，操作簡便，不需去蛋白等處理，適于自動分析，是血肌酐測定的常規方法，也是二點法在實際檢驗工作中的典型應用，在尿樣重金屬檢測時的尿肌酐檢測中也有重要價值[2]。

相關學者研究我國1 402家臨床實驗室肌酐檢測系統的性能，室間質量評價EQA顯示堿性苦味酸法CV為1.03%～18.23%，酶法CV為1.50%～8.08%，與酶法相比，可見Jaffe法雖經各種改良，但并沒有從根本上改變非特異性反應的問題。

1.2 硫酸銅肌酐復合物氧化Metol光度法

相關研究者[3]于2017年進行硫酸銅肌酐復合物氧化Metol光度法分析，回收率101%～106%，日內CV2.5%～4.8%，日間 CV3.2%～7.8%，線性范圍 4.4～620 μmol/L，與其他分光光度法相比，非特異反應與干擾可以忽略不計，結果不受樣品基質影響，該固定時間法手工與自動分析均可。

此原理由Birdsall和Weber提出，硫酸銅與肌酐生成硫酸銅肌酐復合物，此復合物選擇性氧化對-甲基氨基苯酚硫酸鹽（Metol米吐爾）并被還原為硫酸亞銅肌酐復合物，導致形成亞胺基團并呈現深紫色，硫酸亞銅肌酐復合物的量與亞胺基團的生成量成正比，室溫（27±5℃）30 min，在 530 nm 處定量檢測。

1.3 酶法

酶法是基于肌酐經酶促反應而建立，目前報道有4條反應途徑。

1.3.1 肌酐酰胺水解酶法 第一個酶法于1975年由Moss等報道，在肌酐酰胺水解酶（Creatinine amidohydrolase，EC3.5.2.10）也稱肌酐酶（Creatininase)、肌酸激酶（CK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）催化下，肌酐經肌酸、磷酸肌酸、丙酮酸生成乳酸，還需要還原型輔酶I、ATP和磷酸烯醇式丙酮酸參與反應，340 nm處動力學法檢測，由標準曲線確定濃度。線性范圍100 mg/L，回收率102%，1.0g/L的肝素、草酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、抗壞血酸鹽或葡萄糖對測定沒有顯著影響；但30 g/L時對試驗有抑制作用。該原理偶聯四步反應使影響因素增加，內源性肌酸、肌酸磷酸、丙酮酸等會使結果偏高，以雙試劑法消除之，即以肌酐酰胺水解酶構成試劑R2，其他成份組成試劑R1。該法曾被作為參考方法候選，但還原型輔酶I的高度不穩定和試劑高成本為臨床實際應用帶來障礙。

1.3.2 肌酐亞氨基水解酶-GLDH法1982年Tanganelli等報道了由肌酐亞氨基水解酶（creatinine iminohydrolase，EC3.5.4.21）催化肌酐生成N-甲基乙內酰脲和銨根，產物銨根再參與形成谷氨酸，20～37℃，15 min到達終點，340 nm處吸光度降低速率標準對照求得肌酐含量。反應的另一個工具酶是谷氨酸脫氫酶（GLDH，EC1.4.1.3），需 α-酮戊二酸及還原型輔酶Ⅱ，主要影響為內源性氨的干擾，Tanganelli采用雙試劑法，試劑R1中含有GLDH、α-酮戊二酸、NADPH，消除內源性氨影響，再加試劑R2含肌酐亞氨基水解酶啟動檢測，為消除基質中其他脫氫酶（NADH）的影響，GLDH采用NADPH作輔酶。線性范圍884 μmol/L，血清和尿液肌酐的平均回收率99%，肌酐335 μmol/L和80μmol/L時，批內 CV2%，批間 CV6%，肌酐亞氨基水解酶法 （y=0.987x-13.2）與Jaffe動力學法 （y=1.01x-12.8）結果相當，在去蛋白和Fuller’s土吸附后的Jaffe測試為（y=0.985x-3.08）。該原理僅需二步酶偶聯反應，試劑組分少，影響因素和試劑成本下降，主要缺點是還原型輔酶Ⅱ不夠穩定。

1.3.3 肌酐酰胺水解酶-肌酸脒基水解酶-Trinder反應法 1983年Fossati等報道了一個基于過氧化氫測量的新酶促比色法，在肌酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶（creatine amidinohydrolase，EC3.5.3.3）也稱為肌酸酶（Creatinase）、肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，EC1.5.3.1）、過氧化物酶POD催化下，肌酐經肌酸、肌氨酸生成過氧化氫，再利用著名的Trinder反應，色原體為 3，5-二氯-2-羥基苯磺酸（鈉）鹽（DHBA）和 4-氨基苯腙，室溫30 min內510 nm處比色測定。線性范圍高達2.21 mmol/L，回收率平均99.8%，肌酐69 μmol/L時，批內CV3.3%，批間CV4.3%，與Wahlefeld的酶法紫外法和Fuller’s土Jaffe法結果一致（r大于0.99）。此檢測波長為可見光，靈敏度高，線性范圍寬，試劑組分簡化，穩定性高，試劑成本下降，目前商品試劑盒多采用此法，是酶法的代表。

但指示系統也存在rinder反應固有的優缺點，除維生素C等，藥物酚磺乙胺[4]、羥苯磺酸鈣[5]可消耗過氧化氫形成明顯負干擾，但酚磺乙胺對肌酐亞氨基水解酶-GLDH（紫外）酶法無影響[6]、羥苯磺酸鈣對苦味酸法基本無干擾[7]。

1.3.4 N-甲基乙內酰脲酰胺水解酶-Trinder反應法1995年Ogawa等建立起一個基于通過N-甲基乙內酰脲的肌酐降解途徑，原理如下：

肌氨酸再經肌氨酸氧化酶生成過氧化氫，POD催化Trinder反應，510 nm處比色測定。五個工具酶中N-甲基乙內酰脲酰胺水解酶 （N-methylhydantoin amidohydrolase，EC3.5.2.14）和N-氨基甲酰肌氨酸酰胺 水 解 酶 （N-carbamoylsarcosine amidohydrolase，EC3.5.1.59）是兩個關鍵酶，其中N-甲基乙內酰脲酰胺水解酶打開咪唑啉環需消耗1分子ATP，酰胺水解酶需依賴ATP較少見。基質中氨和肌酸不參與反應，故特異性和靈敏度高，但國內該法的應用較少，可能與關鍵酶來源困難有關。

可見，酶法從根本上解決了反應特異性的問題，適于自動分析，是目前臨床上檢測Cr的主流方法，但仍存在內源、外源性干擾、試劑不穩定等問題，同時酶試劑成本比苦味酸試劑貴得多。

1.4 化學發光法與熒光勻相法

化學發光技術因其靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快等特點，替代同位素技術且無放射性污染而在臨床上被快速應用，程武等建立了可手工檢測肌酐的化學發光勻相法和熒光勻相法。化學發光勻相法的線性范圍1 225 μmol/L，回收率100.2%，批內和批間為CV2.06%、3.29%；熒光勻相法的線性范圍1 280 μmol/L，回收率為101.2%，批內和批間CV1.63%、4.27%。但尚未見臨床應用的報道。

1.5 毛細管電泳法

毛細管電泳法檢測肌酐的研究和應用僅十余年時間，張燕玲等用國產TH-2000毛細管電泳儀，將血清直接 （或過濾后）進行二氧化硅毛細管膠束電泳，235nm處紫外檢測定量，線性范圍25～1 600 μmol/L，高、中、低濃度的回收率分別為96.5%、99.4%、96.0%，批內、日內CV均小于5%，檢出限12.3 μmol/L，與全自動生化分析儀 （堿性苦味酸法）測定結果相關系數r=0.997 7。趙紹林等實驗顯示，線性范圍4.32～8840 μmol/L，回收率 99.6%，日內、日間 CV 均小于4.8%，檢出限0.977 μmol/L。該方法簡單快速，分離效果好，線性范圍寬，困擾Jaffe法和酶法中的非特異性及尿素、尿酸、咖啡因、維生素C、血紅蛋白、膽紅素、脂血等的干擾問題都不存在，但相對于分光光度法需使用特殊設備，臨床常規使用仍有不便。

1.6 拉曼散射法

2005年Rainer Stosch等提出了表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）法檢測肌酐。以2-13C，2，3-15N2同位素標記的肌酐為內標，0.02 mol/L的NaCl誘導銀膠體粒子發生部分聚集，20 μl反應液石英杯中混勻檢測，以標記物肌酐和天然肌酐特征拉曼散射峰強度對比計算結果。CV小于2%。該原理與ID-MS類似，雖無需質譜儀，但因使用同位素，不便于常規檢測。

1.7 電極法

利用離子選擇電極制備相應的酶電極檢測肌酐，是建立在酶促反應基礎上的電化學技術。操作簡單，速度快，適合POCT，但具有酶法抗內源性物質干擾能力較差的特點，臨床應用較少。

1.8 高效液相層析（HPLC）法

HPLC通過陽離子交換層析柱分離肌酐，233～236 nm處檢測。線性范圍1～2000 μmol/L，回收率97%～102%。HPLC法分離性能強，大大降低了檢測的非特異性和干擾，準確度和精密度均較Jaffe法和酶法高，但樣品前處理及檢測過程較繁瑣，用時較長，不太適合臨床大批量樣本檢測。IFCC將離子交換層析法確定為Cr測定的參考方法。

1.9 同位素稀釋質譜（isotope dilution mass spectrometry，ID-MS）法

ID-MS是將已知質量和豐度的同位素標記物作為稀釋劑與樣本混合，平衡后通過質譜檢測標記物混合前后同位素豐度的變化，計算樣本中元素（或溶質）含量。ID-MS法不受基質效應等影響，特異性、準確度、精密度都很高，幾乎無系統誤差，是IFCC常用的決定性方法，其測定結果與真值最為接近。由于技術條件、輻射污染等問題，這類方法通常只用于產生一級參考測量程序、評價參考方法和對一級校標準品定值。

同位素稀釋-氣相色譜-質譜法（isotope dilutiongas chromatography mass spectrometry，GC-ID-MS）以13C和15N2肌酐作為標記物，通過陽離子交換柱分離提純肌酐，再用GC-ID-MS檢測。該方法的準確度高，但樣本處理比較復雜，費時且成本高。

同位素稀釋-液相色譜-質譜法（isotope dilutionliquid chromatography mass spectrometry，LC-ID-MS）樣本經離心、沉淀蛋白質、過濾后便可直接進樣檢測，樣本前處理較GC-ID-MS簡單，且檢測偏差與GCID-MS相當。國際上將此方法作為肌酐檢測的決定性方法。

2 國內外血清肌酐檢測參考測量系統及量值溯源性研究現狀

國內外的能力驗證PT和EQA執行的評價標準均依據CLIA’88允許誤差范圍，肌酐：靶值±26.5 μmol/L或靶值±15%（取最大值）。2005年Greg等報道，美國病理學家協會（CAP）發放血清標本檢測肌酐，回收5 624有效結果 （約1125個實驗室），ID-MS賦值79.7 μmol/L的標本，在50種儀器方法相同組內存在-5.3～27.4 μmol/L的偏差。目前，美歐等國對血清肌酐的參考測量系統經詳細研究，采用GC-ID-MS和LC-ID-MS兩種方法為肌酐定值以實現結果溯源。我國也已起步，繼血清膽固醇檢測具有比較完整的參考系統后，2013年頒布了我國衛生行業標準WS/T414-2013《血肌酐測定參考方法——同位素稀釋液相色譜串聯質譜法》，同年宋云霄等[8]對ID-MS、酶法和堿性苦味酸法比較顯示，酶法與LC-ID-MS的測定結果可比性較好,Y酶法=0.964XIDMS+0.385，r=0.994,平均偏差-2.93%，Jaffe法結果明顯偏高，與LC-ID-MS比較為YJaffe=0.955XIDMS+13.14，r=0.979，平均偏差 13.9%，溶血和高脂對酶法和Jaffe法均有干擾使結果偏低。2015年金中淦[9]對152家實驗室進行肌酐正確度調查，依據國際檢驗醫學溯源聯合委員會（JCTLM））推薦方法,應用LC-ID-MS方法賦值58.80umol/L的樣本，酶法和Jaffe法的檢測結果與相對偏移分別為67.60 μmol/L，14.97%；71.38 μmol/L，21.39%；LC-IDMS賦值300.69 μmol/L的樣本，酶法和Jaffe法的檢測結果與相對偏移分別為294.92 μmol/L，-1.92%；307.86 μmol/L，2.38%， 驗證了 LC-ID-MS測定血清肌酐的方法準確度、精密度均較好，同時提示臨床實驗室低濃度肌酐檢測的準確度和一致性值得重視；牛長春等[10]提出雙濃度水平校準可糾正苦味酸法在低值范圍存在的正偏移；李有強[11]對肌酐在不同檢測系統間的測定不確定度和量值溯源進行了評估，結果顯示具有可比性；歐陽后先[12]還研究了全自動生化分析儀丙氨酸轉氨酶-肌酐（ALT-Cr）順序檢測會使肌酐結果顯著偏高，可改換為α-L-巖藻糖苷酶-肌酐（AFU-Cr）順序檢測以消除；王正印等[13]總結了多種藥物對Jaffe法與酶法帶來正向或負向干擾，造成檢測結果的偏倚。

方法的多樣性是技術不斷發展進步的必然結果，量值的溯源性是檢驗醫學的永恒主題。臨床上肌酐的檢測方法、儀器、試劑（盒）種類各異客觀存在，為使不同方法、系統之間的測定結果準確、可比，建立肌酐檢測的體外診斷參考測量系統并保證ISO17511計量學溯源性，深入研究內源物質及藥物對肌酐檢測的干擾機制，不斷追求檢測結果的準確度和精密度，是國際國內肌酐檢測的發展趨勢。