高效液相色譜法測定血液透析器中二苯基甲烷二異氰酸酯的溶出量

徐蘇華（通信作者），柯軍，顏林，葉曉燕，梁澤鑫

廣東省醫療器械質量監督檢驗所 （廣東廣州 510006）

血液透析通過彌散、對流、超濾、吸附等機制清除體內有害物質，維持水電解質平衡[1]。血液透析器簡稱透析器，是血液和透析液進行溶質交換的管道和容器，是血液透析的關鍵部分。透析器主要由支撐結構和透析膜組成，后者是其重要組成部分，為半透膜，只允許小于膜孔徑的分子通過，膜材料為改良的纖維素膜和合成膜兩種，兩者均可制成高通量的透析器。聚氨酯密封膠在醫學領域中的應用主要是血漿分離器等中空纖維型血液透析裝置的密封,人工肝、腎器官的灌注密封等。血液透析器的主要部件中空纖維束是由密封膠澆注粘結固定在透析器的外殼之中的[2]。

二苯基甲烷二異氰酸酯（diphenylmethane diisocyanate，MDI）在工業上廣泛用于制造硬質泡沫、熱塑性聚氨酯彈性體、涂料、粘合劑、彈性纖維、建筑材料等[3-5]。血液透析器中的聚氨酯密封膠便是由MDI合成而來，MDI因兩個異氰酸酯基團在苯環上的位置不同，有4,4'-MDI、2,4'-MDI和2,2'-MDI等異構體。制備聚氨酯所用MDI以4,4'-MDI為主。4,4'-MDI以氣體形態存在時，具有一定的毒性，會刺激皮膚、眼睛和呼吸道，引起人類哮喘、過敏性肺炎和上呼吸道炎癥等疾病[6]。有研究表明，MDI染毒干擾了睪丸組織的有氧代謝，抑制了細胞對能量的利用,可損傷各級生精細胞，造成生精上皮的損傷,并且通過脂質過氧化反應對睪丸組織造成一定程度的損傷，繼而引起精子生成減少和睪丸重量下降,造成雄性生殖系統的損傷，并且這種損傷呈現出一定的劑量-反應關系[7]。同時，有研究表明，亞慢性毒性、慢性毒性、致癌性試驗中，MDI均有毒性反應，其氣體對小鼠的最小安全劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）為0.19 mg/m3[8-9]。

4,4'-MDI分子式為（C6H4NCO）2CH2，帶有兩個異氰酸酯基（-N=C=O）。MDI固體形態時，通過對小鼠重復給藥發現，4,4'-MDI在與血液接觸后會迅速分解，其主要降解產物為4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA），分子式為C13H14N2。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）將MDI分級為3，即對人體不具備致癌性，而MDA的分級為2B，即可能對人體致癌[6]。國內外對MDI的研究主要為環境中MDI對人體的影響[10-12]，醫療器械中MDI的測量較少報道[13-14]。本研究采用高效液相色譜儀，用甲醇作為浸提介質，模擬臨床使用制備浸提液，建立了檢驗MDI的高效液相色譜法，并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑和樣品

試劑：甲醇（分析純，含量≥99.5%，廣州化學試劑廠）；乙腈（HPLC色譜純，默克股份兩合公司）；4,4'-二氨基二苯甲烷（標準品，99.5%，北京百靈威科技有限公司）；乙酸銨（分析純，含量≥98.0%，廣州化學試劑廠）；去離子水（18.25 MΩ.cm）。樣品：血液透析器（A公司生產，型號：B-20HF）

1.2 試驗儀器及條件

儀器：高效液相色譜儀（日本島津LC-20AT）。條件：色譜柱為 Inertsil?ODS-SP， 4.6 mm×250 mm，5 μm ；流動相為0.05 mol/L乙酸銨/乙腈（70/30）；流速為1.0 ml/min，檢測波長為250 nm，進樣量為20 μl。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液制備

稱取50 mg 4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA）對照品于100 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋制成500 μg/ml的MDA母液。取母液用乙腈逐級稀釋分別配制0.5 μg/ml、0.7 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml的系列對照品溶液。對照品溶液經0.45 μm濾膜過濾，在上述色譜條件下進行測定，每個濃度重復測定3次取平均值，得到MDA標準曲線。

1.3.2 浸提液和供試液的制備

取一套樣品與玻璃燒瓶連成一個循環系統，加入500 ml甲醇并保持在（37±1 ）℃，通過蠕動泵作用于一段盡可能短的硅橡膠管上，使甲醇分別以200 ml/min和400 ml/min的流量循環5.5 h，得到浸提液1和浸提液2。不接透析器同法制備空白溶液。分別取空白溶液、浸提液1和浸提液2各50 ml在40 ℃下旋轉蒸干，將殘留物溶解在2 ml 乙腈中，經0.45 μm濾膜過濾，得到空白供試液、供試液1和供試液2。

2 結果

2.1 專屬性

空白溶液和濃度為0.5 μg/ml的MDA對照樣品溶液，在上述色譜條件下進行測定，結果見圖1。結果顯示MDA的保留時間約為17.000 min，理論塔板數為10 532，分離度為29，拖尾因子0.984，空白溶液無待測物質峰，待測物質與其他峰無干擾，表明該色譜條件可用來測定MDA的含量。

圖1 液相色譜圖

在1.2的色譜條件下進樣分析，以各組分濃度峰面積和對照品濃度作圖，得到MDA標準品曲線，見圖2。回歸方程為Y=86678.4X＋168.116，相關系數r=0.99996123，表明MDA濃度在0.5～5.0 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.2 檢測限與定量限

取MDA對照品溶液，按需求等比稀釋，將得到的低濃度對照品溶液進行檢測。檢測限：平均信噪比（S/N）約3.5時，最低檢測濃度為0.02 μg/ml；定量限：平均信噪比（S/N）約為10時，檢測濃度為0.05 μg/ml。

2.3 精密度

圖2 MDA對照品線性圖

重復性：取濃度為0.5 μg/ml、1.25 μg/ml、5.0 μg/ml的標準品各連續測定3次，計算峰面積（即濃度）的RSD值，如表1。中間精密度：在不同天由不同分析人員平行制備同重復性濃度相同的各3份標準品連續測定計算峰面積（即濃度）的RSD 值，如表2。根據中國藥典（2015年版）9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則，當樣品濃度為1 μg/ml級別時，重復性RSD應≤8%，中間精密度RSD應≤16%[15]。從表1和表2可以看出，重復性RSD為0.096%～0.30%，日間精密度RSD為0.14%～0.52%，符合中國藥典的相關要求。

表1 重復性試驗結果（n=3）

表2 日間精密度試驗結果 （n=3）

2.4 回收率

取加標濃度為0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的樣品各3份，分別測定3次，計算平均回收率，如表3。加標樣品制備方法：取樣品9份，向其中加入標準品，制備理論濃度為0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的樣品各3份。根據中國藥典（2015年版）9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則，當樣品濃度為1 μg/ml級別時，回收率應符合80%～120%[15]。從表3可以看出，平均回收率為99.88%～103.33%，符合中國藥典的相關要求。

表3 回收率試驗結果（n=3）

2.5 樣品MDI溶出量

空白供試液、供試液1、供試液2的MDA濃度及每套血液透析器MDI溶出量見表4，色譜圖見圖3。

計算過程如下：在浸提溶劑中，MDI轉變為MDA，且是等濃度轉變，因此，供試液中MDA的濃度即為MDI的濃度。MDI溶出量 M=（C供試液×2）×（500/50）=20C供試液。其中，M為每套血液透析器中MDI溶出量，單位為μg；C供試液為供試液MDA濃度，單位為μg/ml；2為復溶使用的乙腈體積，單位為ml；500為每套血液透析器制備的浸提液體積，單位為ml；50為旋轉蒸干的浸提液體積，單位為ml。空白供試液1和空白供試液2未檢出，因此，其MDA濃度均小于檢出限，即為＜0.02 μg/ml。

表4 血液透析器中MDI溶出量結果

圖3 MDA含量液相色譜圖

3 討論

因MDI在水中極易水解生成MDA，因此本研究以MDA為對象進行。美國毒物和疾病登記署（Agency for Toxic Substances and Disease Registry ，ATSDR）及美國國家衛生基金會（National Sanitation Foundation，NSF）評估了MDA的毒性，給出了短期每日安全劑量值，根據小鼠重復給藥12周得到的最小安全劑量值為8.3 mg/（kg·d），采用不確定因子100（100=10×10，10為物種間差異，10為人體間差異），則人員短期每日安全劑量值為8.3/100=0.083 mg/（kg·d），即為可耐受攝入量TI值。

采用GB/T16886.17-2005《醫療器械生物學評價第17部分：可瀝慮物允許限量的建立》中公式推導，可耐受限量TE=TI×m×UTF，UTF=CEF×PEF，PEF=nexp/nuse，則可耐受限量TE=TI×m×CEF×（nexp/nuse）。公式中：TI為耐受攝入量，0.083 mg/（kg·d）；m為醫療器械接觸群體的體重，以體重70 kg計；CEF為多器械因子，缺省值為0.2；nexp為一種器械接觸類別的天數，本產品最高接觸6 h，0.25 d；nuse為器械的使用時間，本產品最高使用時間6 h，0.25 d。則 MDI的可耐受限量 TE=0.083×70×0.2×（0.25/0.25）=1.162 mg/次，因本產品為一次性使用，即可認為產品中MDI的最高溶出限量為1.162 mg/套。當流速分別為200 ml/min和400 ml/min時，每套血液透析器MDI含量分別為5.82 μg、5.98 μg，均在安全限量范圍之內。

本研究建立了高效液相色譜儀檢測血液透析器中MDI溶出量的分析方法，該方法具有處理簡單、重復性好、定量準確等特點。同時，本研究進一步推導了血液透析器中MDI的安全限量值，可為使用聚氨酯密封膠密封血液透析器的醫療器械生產企業提供很好參考價值。