左氧氟沙星耐藥小鼠模型的建立

崔煦然，丁軍穎，趙京霞，郭玉紅，崔曉蘭，劉清泉*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；3.中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010；4.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700)

細菌性肺炎是常見的重癥肺炎。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是引起醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機相關肺炎最多見的革蘭陰性桿菌之一[1]，常見發(fā)生于患有多種基礎疾病或免疫力低下的患者[2-3]。PA耐藥性強，耐藥譜廣，對多種抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性耐藥[4]。1979 年，Cash等[5]以氣管切開注射的方式構建了PA致小鼠肺部感染的模型；1994年，童明慶等[6]采用肺炎克雷伯菌攻擊小鼠肺臟造成肺部感染，從而成功地建立了小鼠實驗性支氣管肺炎模型；2009年李建生等[7]采用細菌滴注和風熱刺激結合模型的方法建立了肺炎克雷伯桿菌肺炎痰熱證模型。這些模型的制備充分證實了細菌性肺炎模型的可行性。為了探索PA體內(nèi)耐藥性產(chǎn)生的變化和治療方法，需要建立一種實驗模型來進行深入研究。因此，本實驗擬通過體內(nèi)實驗，結合重癥肺炎診斷標準進行左氧氟沙星耐藥研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級ICR小鼠96只，雌雄各半，體重為(14±1)g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，[SCXK(京)2012-0001]。實驗在中國醫(yī)學科學院中藥研究所生物安全實驗室[SYXK(京)2013-0035]進行，實驗操作經(jīng)過北京市中醫(yī)研究所動物倫理委員會審批，審批編號：2015010201，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 細菌株

PA標準株27853，購自ATCC，實驗室傳代1次后，-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

左氧氟沙星片：第一三共制藥(北京)有限公司，生產(chǎn)批號：BNO11A1；氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司產(chǎn)品，批號1402261909；MH肉湯：Oxoid公司，批號1583507；乙醚為普通市售分析純。

生物安全柜：購自Thermo公司，型號ThermoMSC1.8/1.2；電子天平(稱肺重)：購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號AL204；電子天平(稱體重)：購自上海越平科學儀器有限公司，型號YP1002；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司，型號HZQ-F160；超低溫冰箱：購自Thermo公司，型號ULT Freezer。

1.3 實驗方法

1.3.1 劑量設計

(一)左氧氟沙星：人臨床用量為0.3 g/60(kg·d)，試驗時小鼠的等效劑量為0.055 g/(kg·d)。試驗中低劑量標準認為未達到臨床左氧氟沙星使用劑量。本次試驗采用五個劑量，即0.0275、0.037、0.055、0.073、0.092 g/(kg·d)，分別為臨床劑量的0.5、0.67、1、1.33、1.67倍，0.0275、0.037 g/(kg·d)即為低劑量。藥物試驗時，小鼠按0.2 mL/10 g體重灌胃給藥。

(二)PA菌液：取一定量的菌液，加入MH營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。試驗時，采用比濁法調(diào)整菌液至試驗濃度。

1.3.2 低濃度左氧氟沙星對PA(1×109cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用[8]

取ICR小鼠30只，雌雄各半，按體重等級隨機分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組(左氧氟沙星組1)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組2)，每組6只。各組動物麻醉后，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d，模型對照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.3 低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用[8]

取ICR小鼠36只，雌雄各半，按體重等級隨機分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組1(左氧氟沙星組1)、左氧氟沙星臨床治療劑量組2(左氧氟沙星組2)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組3)，每組6只。各組動物用乙醚輕度麻醉，以1×1010cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d，模型對照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.4 低濃度左氧氟沙星對PA重復感染小鼠肺炎模型的作用8]

取ICR小鼠30只，雌雄各半，按體重等級隨機分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組(左氧氟沙星組1)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組2)，每組6只。各組動物用乙醚輕度麻醉，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，模型對照組在同等條件下蒸餾水灌胃。于第4天，各組動物再次用乙醚輕度麻醉，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，模型對照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.5 診斷標準[9]

參照文獻中大鼠細菌性肺炎模型診斷標準，本次試驗小鼠肺炎模型的判定標準確定為

(1)出現(xiàn)行動緩慢、毛色暗淡、攝食飲水量減少等；(2)肺組織增重；(3)誘導→給藥組，肺組織增重即視為耐藥性產(chǎn)生。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 低濃度左氧氟沙星對PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用

2.1.1 狀態(tài)觀察

圖1 低濃度左氧氟沙星對PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠體重變化Figure 1 Weight changes in the single PA infection mice (1×109 cfu/mL) plus a low-dose levofloxacin

各組小鼠感染前一般狀態(tài)正常。第2天，模型組1、模型組2、左氧氟沙星組2小鼠表現(xiàn)出蜷縮聚集、行動緩慢、毛色暗淡、部分小鼠眼眶可見分泌物，攝食攝水量減少；左氧氟沙星組1小鼠毛色暗淡、行動緩慢、攝食攝水量減少。第3天，模型組1、模型組2、左氧氟沙星組2小鼠毛色暗淡、行動緩慢、聚集現(xiàn)象不明顯，攝食攝水量增加；左氧氟沙星組1小鼠毛色暗淡、攝食攝水量增加。第4～7天各組小鼠逐漸恢復，一般狀態(tài)與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實驗過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.1.2 體重觀察

在試驗周期內(nèi)，正常組小鼠體重每天均有增長；各感染組小鼠體重呈現(xiàn) “V”型趨勢，體重值與正常組比較無顯著性差異；于第3天，各感染組小鼠體重逐漸增長，增長趨勢基本一致；至第7天，感染組小鼠體重值基本達到正常小鼠體重水平。結果如圖1所示。

表1 低濃度左氧氟沙星對PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用Table 1 Effect of a low-dose levofloxacin and single PA infection on the mice with pneumonia (1×109 cfu/mL)

注：與正常組比較，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01.

2.1.3 肺指數(shù)檢測

各感染組小鼠肺指數(shù)均有不同程度的增高，其中模型組1、模型組2肺指數(shù)與正常組比較，均有顯著性差異(P<0.01)；左氧氟沙星組1肺指數(shù)與各組比較，均無顯著性差異；左氧氟沙星組2與模型組2比較，結果無顯著性差異。結果如表1所示。

2.2 低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用

2.2.1 狀態(tài)觀察

各組小鼠感染前一般狀態(tài)正常。第2天，感染組小鼠皆表現(xiàn)出蜷縮聚集、行動緩慢、毛色暗淡、部分小鼠眼眶可見分泌物，攝食攝水量減少。第3天，感染各組小鼠毛色暗淡、行動緩慢、攝食攝水量不明顯；左氧氟沙星組2小鼠毛色暗淡、攝食攝水量增加。第4～7天各組小鼠逐漸恢復，左氧氟沙星組1、2小鼠恢復迅速，至第7天，一般狀態(tài)與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實驗過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.2.2 體重觀察

圖2結果顯示：在試驗周期內(nèi)，正常組小鼠體重每天均有增長；各感染組小鼠體重呈現(xiàn)先下降后增長的趨勢：于第二天體重明顯下降(或者增長緩慢)，體重值與正常組比較無顯著性差異；于第三天，各感染組小鼠體重逐漸增長，增長速度各不相同，其中左氧氟沙星2組小鼠體重增長速度相對較快；至第七天，左氧氟沙星組1、2小鼠體重值基本達到正常小鼠體重水平。

2.2.3 肺指數(shù)檢測

表2結果顯示：各感染組小鼠肺指數(shù)均有不同程度的增高；模型組1和模型組2與正常組比較，結果均有顯著性差異(P<0.01)。左氧氟沙星組1、2肺指數(shù)結果與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；左氧氟沙星組3與模型組2比較，結果無顯著性差異。

2.3 低濃度左氧氟沙星對PA重復感染小鼠肺炎模型的作用

2.3.1 狀態(tài)觀察

實驗第1～4天，各組小鼠一般狀態(tài)表現(xiàn)與實驗低濃度左氧氟沙星對PA(1×109cfu/mL)單次感染中小鼠第1～4天表現(xiàn)相似。第5天各感染組小鼠攝食攝水量減少、行動緩慢、毛色暗淡，但較第一次感染后狀態(tài)相對較好。第6～7天，感染組小鼠一般狀態(tài)迅速恢復，與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實驗過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.3.2 體重觀察

圖1結果顯示：正常組小鼠體重在試驗周期內(nèi)，每天均有增長；各感染組中，左氧氟沙星組1小鼠體重較正常組比較，增長趨勢相似；其他各組小鼠體重整體均呈現(xiàn)“W”型增長趨勢：第一次感染后，于第二天體重均有下降，于第三天，各組小鼠體重逐漸增長，結果與正常組比較均無顯著性差異。各組小鼠第二次感染后，左氧氟沙星組1小鼠體重較正常組比較，呈現(xiàn)增長趨勢；其余各組小鼠，體重均有所下降。于第六天，各組小鼠體重逐漸增長，結果與正常組比較均無顯著性差異。

2.3.3 肺指數(shù)檢測

表5結果顯示，各感染組小鼠肺指數(shù)均有增高；模型組1和模型組2與正常組比較，均有顯著性差異(P<0.01)。左氧氟沙星組1與模型組1比較，結果有顯著性差異(P<0.01)；左氧氟沙星組2與模型組2比較，結果無顯著性差異。

表2 低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用Table 2 Effect of a low-dose of levofloxacin on the mice after single PA infection (1×1010 cfu/mL)

注：與正常組比較，##P<0.01。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01. Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖2 低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠體重變化Figure 2 Effect of a low-dose of levofloxacin on weight changes in mice with single PA infection (1×1010 cfu/mL)

圖3 低濃度左氧氟沙星對PA重復感染小鼠體重變化Figure 3 Effect of a low-dose of levofloxacin on weight changes in mice with repeated PA infection

表3 低濃度左氧氟沙星對PA重復感染小鼠肺炎模型的作用Table 3 Effect of a low-dose of levofloxacin on the mice with pneumonia receiving repeated PA infection

注：與正常對照組比較，##P<0.01。與模型組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01. Compared with the model group,**P<0.01.

3 討論

銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院感染的重要條件致病菌[10-11]，尤其易發(fā)生ICU 病房和老年人肺部感染[12]，而對該菌的致病性和耐藥性的研究，理想的動物模型是研究基礎。PA屬于致病力低而抗藥性較強的一種桿菌[13]，可從淡水和土壤中分離[4]，廣泛分布于腸道、皮膚及呼吸道[14-15]。近些年，PA 肺炎發(fā)病率呈不斷升高趨勢[16]。左氧氟沙星是一種臨床廣泛應用的氟喹諾酮類藥物[17]，對PA具有良好的抗菌活性。部分監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，PA對氟喹諾酮類藥物的耐藥性現(xiàn)狀仍需重視[18]。左氧氟沙星為氟喹諾酮類藥物之一[19]，具有口服生物利用度高、半衰期長、不良反應小等特點，主要通過抑制細菌的 DNA旋轉酶發(fā)揮抗菌作用[20]。左氧氟沙星對多數(shù)腸桿菌科細菌，有較強的抗菌活性[21]。但隨著細菌耐藥現(xiàn)象的加劇，耐左氧氟沙星PA也成為臨床常見菌株[22]。同時，結合文獻檢索結果，細菌感染模型的構建，體外多涉及抗生素刺激誘導細菌耐藥性產(chǎn)生、耐藥基因表達變化等[23-24]；體內(nèi)感染研究多涉及到囊性纖維化模型、燒傷模型等[25]。因此，本次試驗旨在探討左氧氟沙星誘導致PA感染小鼠肺炎耐藥模型的建立方法。

小鼠對多種病原體具有易感性，常用來研究微生物及寄生蟲對機體的感染途徑、發(fā)病機制及綜合防治。實驗中以小鼠肺炎模型為基礎[8]，通過不同的給藥方法、不同感染次數(shù)，模擬不合理用抗生素而致藥效降低甚至無效的臨床問題。通過組間對照比較分析，以體重和肺指數(shù)為評價指標，旨在探討一種簡單而可行的實驗方法，實驗共涉及三部分：①低濃度左氧氟沙星對PA(1×109cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用中，結果可推測出PA感染可致小鼠肺部感染；同時左氧氟沙星組2與模型組2比較結果無顯著性差異，提示低劑量左氧氟沙星干預，對于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響；結合左氧氟沙星組1小鼠肺指數(shù)與各組比較均無顯著性差異，猜測該條件下PA感染的濃度稍低，或者在該實驗條件下左氧氟沙星的治療劑量稍低。②在上述實驗結果的基礎上，增高PA感染菌液的濃度，并適當提高左氧氟沙星的治療劑量進行實驗。低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用中，結果顯示該條件下PA感染小鼠成功；左氧氟沙星組1、2均能顯著性降低模型組肺指數(shù)，表明該方法下左氧氟沙星產(chǎn)生了有效治療作用；結合左氧氟沙星組3與模型組2比較結果無顯著性差異，提示低劑量左氧氟沙星干預，對于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響。進而推測低濃度左氧氟沙星可致PA感染小鼠肺炎模型對左氧氟沙星耐藥性產(chǎn)生。③進一步優(yōu)化實驗方法，以低濃度菌液重復感染小鼠，結果顯示：該條件下PA感染小鼠成功。左氧氟沙星組對模型小鼠產(chǎn)生了有效治療作用；而左氧氟沙星組2結果提示低劑量左氧氟沙星干預，對于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響。該實驗提示，低濃度左氧氟沙星可致PA感染小鼠肺炎模型對左氧氟沙星耐藥性產(chǎn)生。此外，各試驗中小鼠體重監(jiān)測結果中各組小鼠感染PA后，第二天體重較正常組比較雖無顯著性差異，但均有下降趨勢， 表明PA肺炎模型小鼠感染成功可以參考體重數(shù)據(jù)。

綜合以上信息分析，小鼠滴鼻感染致細菌肺炎模型操作簡單，在此條件下通過左氧氟沙星不同給藥量和給藥方式的作用，實驗低濃度左氧氟沙星對PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠、低濃度左氧氟沙星對PA重復感染小鼠中，動物模型可在一定程度上模擬臨床中耐藥產(chǎn)生的現(xiàn)象。但本次實驗中評價指標相對單一，后續(xù)試驗中應注重實驗動物生理病理狀態(tài)，以及相關機制的研究。