ＨＰＬＣ法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸的含量

保花艷

【摘要】目的：建立HPLC法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸的含量。方法：采用ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇-0.025%磷酸溶液（4.5∶95.5），流速1.0mL/min，檢測波長為272nm;柱溫25℃。結果：沒食子酸在0.9316～46.58μg/mL范圍內呈良好線性關系，r=1.0000;平均回收率為99.8%，RSD=1.4%（n=6）。結論：該方法簡捷，快速，可靠，可用于控制制劑的質量。

【關鍵詞】鱉甲消痔膠囊;沒食子酸;含量測定;高效液相色譜法

【中圖分類號】R917【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0036-03

Abstract：ObjectiveToestablishamethodofthecontentdeterminationofgallicacidintheAojiaxiaozhicapsulebyHPLC.MethodThermoC18column（250mm×4.6mm，5μm）wasadopted.Themobilephasewasmethanoland0.025%phosphoricacidsolution（4.5∶[KG-*3/5]95.5），withtheflowrateof1.0mL/min，anddetectionwavelengthof272nm.Thecolumntemperaturewas25℃.ResultsTherewasagoodlinearityintherangeof0.9～186.3μg/mL，r=1.0000.Theaveragerecoverywas100.3%，withRSDof1.9%（n=6）.ConclusionThemethodissimple，rapidandreliable.ItcouldbeusedtocontrolthequalityoftheAojiaxiaozhicapsule.

Keywords：AojiaxiaozhiCapsule;GallicAcid;ContentDetermination;HPLC

鱉甲消痔膠囊由地榆、地瓜藤、黃柏、土大黃、鱉甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中藥配伍而成，具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛的功效。用于濕熱蘊結所致的內痔出血、外痔腫痛、肛周瘙癢。文獻查詢發現，目前對該制劑的研究主要有：用TLC法對大黃、地榆、槐角、梔子進行鑒別;用高效液相色譜法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量[1-2]。為了進一步研究該制劑，筆者選取該制劑中一種臣藥地榆，建立HPLC法測定地榆中沒食子酸的含量。地榆屬薔薇科植物，采挖后除去須根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、癰腫瘡毒等癥。有文獻[3-4]對地榆的抗炎抑菌作用進行了研究，研究表明地榆對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌，甲型鏈球菌等細菌具有很好抑制作用。地榆中化學成分主要為鞣質類、三萜皂苷類、黃酮類[5]，其中鞣質類化合物是地榆的主要有效成分，沒食子酸是鞣質的重要組成成分，也是評價地榆質量的主要指標[6]。沒食子酸是自然界中廣泛存在的一種多酚類化合物。有研究表明，沒食子酸具有止血、抗炎、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、殺錐蟲等多種生物活性[7-8]。有研究證實沒食子酸體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用[9-10]。本實驗建立高效液相色譜法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸含量。

1儀器與試藥

1.1儀器AgiLent1260高效液相色譜儀（配置四元泵、自動進樣器、UV檢測器）;ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;XS105電子分析天平（梅特勒上海公司）。

1.2試藥沒食子酸（90.1%，批號：110831-200803，中國食品藥品檢定研究院）。鱉甲消痔膠囊（批號：1511014、1511038、2576004，貴州漢方藥業有限公司）。流動相用試劑為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：ThermoC18（250×4.6mm，5μm;流動相：流動相0.025%磷酸-甲醇（95.5∶4.5）;流速1.0mL/min;檢測波長272nm;柱溫25℃;進樣量：5μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液制備精密稱取沒食子酸10.34mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.1863mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取沒食子酸儲備液5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品使用液。

2.2.2供試品溶液制備取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%鹽酸溶液10mL，振搖，加入30mL純化水，搖勻，置于電爐上煮沸20min，取下，冷卻至室溫，過濾，收集濾液置于50mL容量瓶中。用水洗滌濾渣，合并濾液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3陰性樣品制備按處方各藥材比例及制法，制得不含地榆的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3系統適用性試驗分別取供試品溶液、對照品溶液，按上述色譜條件實驗，對系統適用參數進行考察，沒食子酸理論板數為6893。理論板數大于2000[1]。

2.4線性關系考察分別精密吸取2.2.1項下的沒食子酸對照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度;搖勻，即得系列質量濃度的對照品溶液。在2.1項下的色譜條件下測定。以沒食子酸濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，經線性回歸，回歸方程為Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。結果表明：沒食子酸在0.9316～46.58μg/mL范圍內具有良好的線性關系。對照品、供試品、陰性對照的色譜圖見圖1。

2.5精密度試驗取同一濃度的對照品溶液，在2.1項色譜條件下連續進樣測定6次，記錄沒食子酸峰面積，其RSD為0.8%（n=6）。

2.6穩定性試驗取同一在2.2.2項下制備的樣品，在2.1項下色譜條件下分別于2、4、8、16、24h進樣5μL，記錄峰面積，結果測得沒食子酸峰面積RSD為0.8%。表明樣品在24h穩定。

2.7重復性試驗取同一批號樣品（批號：2576004），按照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，在2.1項色譜條件下測定，測得沒食子酸含有量RSD為1.2%（n=6）。

2.8加樣回收率試驗精密稱取含有量已知的鱉甲消痔膠囊（批號2576004）6份，每份約0.4g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.4209mg/mL的沒食子酸對照品溶液2.5mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，計算回收率，結果見表1。

2.9樣品測定結果取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8g，精密稱定，平行3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下測定，計算含有量，結果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇取沒食子酸對照品溶液在200～400nm范圍內進行紫外掃描，沒食子酸在272nm處有最大吸收，與中國藥典地榆含量測定項下選用波長一致，故選擇272nm為檢測波長。

3.2流動相的選擇首先嘗試了甲醇和水做流動相，經進樣檢測，結果峰型不好，然后參考中國藥典[1]地榆含量項下流動相甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），發現峰型變好，但目標峰與相鄰的雜峰分離不是很好，而且雜峰較多，查閱相關文獻[11-13]，改變磷酸溶液濃度為0.025%，發現峰型變好，分離度符合要求，故選擇0.025%磷酸-甲醇（4.5∶95.5）作為流動相。

3.3提取方式的選擇通過參考中國藥典[1]和文獻[14-15]，嘗試用水和不同濃度（30%、50%、70%）的乙醇作為提取溶劑，煮沸和回流兩種提取方式，提取時間（10min、20min、30min、40min）。結果用水做溶劑通過煮沸含量較高，三種不同濃度乙醇回流含量無明顯差異且比水煮沸含量低。提取時間20min、30min、40min含量無明顯變化。但同時發現以上幾種提取出的供試品中目標峰型較差，而且雜峰多，查閱相關文獻[16-17]了解到PH對沒食子酸穩定性影響較大，沒食子酸在酸性條件下穩定，隨PH值增加穩定性逐漸下降，堿性條件下極不穩定。嘗試加入不同濃度（2%、5%、10%、15%）的鹽酸溶液。鹽酸溶液加入體積有5、10mL兩種。結果發現加入10%鹽酸溶液10mL，沒食子酸含量測定值最高且與加入15%鹽酸溶液10mL無明顯差異。綜合以上實驗，確定了本法的提取方式。

參考文獻

[1]孫芳.鱉甲消痔膠囊質量標準研究[J].湖南中醫藥大學學報，2007，8（27）：239-240.

[2]童紅，楊永東，王海寧.HPLC測定鱉甲消痔膠囊中鹽酸小檗堿的含量[J].貴陽中醫學院學報，2001，6（23）：63-64.

[3]吳開云.冰片、虎杖、地榆抑菌作用的實驗研究[J].江西醫學院學報，1996，36（3）：53-55.

[4]周本宏，松長青，姜珊，等.地榆鞣質提取物的抗菌活性及對金黃色葡萄球菌的抑菌機制研究[J].中國藥師，2016，19（3）：464-469.

[5]程東亮，曹小平，鄒佩秀，等.中藥地榆黃酮等成分的分離和鑒定[J].中草藥，1995，261（11）：570-571.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：126.

[7]KoideT，NoseM，InoueM，etal.Trypanocidaleffectsofgallicacidandrelatedcompands[J].Plantamed，1998，64（1）：27-30.

[8]LocatecliC，RossoR，MariaC，eral.EsterderivativesofgallicacidwithpotentialtoxicitytowardL1210leukemiacells[J].BioorganicandwithPotentialMedicinalchemistry，2008，16（1）：3791-3799.

[9]高倫江.余甘子抑菌活性及防腐應用活性研究[D].重慶：西南大學，2008.

[10]劉延麟.沒食子酸單體化合物分離鑒定及藥理活性研究[D].長春：吉林大學，2008.

[11]劉利軍，李瑞蓮.反相高效液相色譜法測定地榆藥材中沒食子酸的含量[J].中國藥師，2009，12（7）：797-980.

[12]沙明，曹愛民，王冰，等.高效液相色譜法測定地榆沒食子酸的含量[J].國藥雜志，1999，24（2）：99-100.

[13]劉志賢.高效液相色譜法測定地榆中沒食子酸的含量[J].臨床經驗與體會，2004，21（2）：164.

[14]藍海，李龍星，肖培云.紫地榆中沒食子酸的提取工藝研究[J].中成藥，2009，31（9）：1456-1457.

[15]常連舉，張宗和，黃嘉玲，等.沒食子酸的制備與應用綜述[J].生物質化學工程，2010，44（4）：48-51.

[16]王廣娟.五倍子沒食子酸的提取、純化及抑菌效果研究[D].保定：河北農業大學，2010.

[17]瞿燕.五倍子發酵工藝及藥理實驗研究[D].成都：成都中醫藥大學，2002.

（收稿日期：2018-07-13編輯：劉斌）