響應面法優化野生五葉草莓總黃酮提取工藝

孫 娜，王 華，朱秀娟，胡文斌，宮崢嶸

(隴南師范高等?？茖W校農林技術學院，甘肅 成縣 742500)

五葉草莓(Fragaria Pentaphylla Losinsk) 為薔薇科草莓屬，又名森林草莓、瓢子，是一種多年生草本植物，廣泛分布于我國秦嶺山脈，資源豐富［1］，市價可觀，十分暢銷，是當地農民季節性收入的來源之一，其果實主要分為白色和紅色兩種［2］，具有清熱止咳、滋養補血、健脾養胃等藥用價值［3-4］。但五葉草莓個頭較普通草莓小，易受擠壓而破損，貯藏運輸十分困難，這嚴重制約了其銷售，造成較大資源浪費，故尋求五葉草莓的深加工方法對其開發與利用具有重要意義。

五葉草莓不僅營養價值高，而且含有多種化學活性物質，尤其是黃酮類化合物含量極高［5］。生物總黃酮又稱黃酮類化合物，是廣泛存在于植物界的一大類以黃酮為母體的天然有機化合物，廣泛分布于蔬菜、水果、牧草和藥用植物中，是植物產生的一類次生代謝產物。研究發現，黃酮類化合物具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血壓、降血脂及抗炎鎮痛等作用，目前已被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等行業［6-8］。

五葉草莓是我國特有的一種野生草莓資源［9］，國內學者對其已有一定研究，但多是側重于其人工栽培方面［10］，對其總黃酮類物質的提取卻鮮有報道。目前對生物總黃酮的提取方法主要有水浸提法、乙醇浸提法、索氏提取法、滲透法、水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法和酶法等。近些年天然活性物質提取多借助超聲波輔助技術，其產生的強烈振動和空化效應等可有效破壞植物細胞壁，加速有效成分釋放，具有縮短提取時間和提高產品提取率等優點［11-14］。為充分利用野生五葉草莓資源，本研究首次將超聲波提取技術應用于五葉草莓黃酮的提取工藝中，利用Box-Benhnken 中心組合設計優化五葉草莓總黃酮提取工藝，旨在為五葉草莓總黃酮的提取及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五葉草莓購自隴南成縣市集。選取大小一致、無破損、無病蟲害的新鮮五葉草莓，清洗瀝干，放置于45 ℃恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒定，粉碎后過40 目篩，備用。

蘆丁標準品購自成都格利普生物科技有限公司;石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，購自西安化玻試劑有限公司。

KQ-700E 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ;SP-756P 紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器公司) ; Buchi R-210 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠) ;GZX-9070MBE 型鼓風干燥烘箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠) ;400Y 型粉碎機(永康市展帆工貿有限公司) ;FA2004N 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司) 等。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮提取工藝

準確稱取2.00 g 五葉草莓干粉，用索氏回流法脫色、脫脂，按一定的液料比(mL/g) 加入一定濃度乙醇溶液，攪拌均勻，在一定溫度下超聲提取一定時間，真空抽濾，減壓濃縮至20 mL，濃縮液用一定濃度的乙醇溶液定容至50 mL。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制與樣品液總黃酮的測定

參照錢慧琴、丁峰等人［15-16］黃酮含量測定方法來制作標準曲線，分光光度計檢測波長為510 nm，以蘆丁標準溶液的質量濃度C 為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，制作標準曲線，結果見圖1，所得標準曲線方程為: A =0.0119C+0.0005，R2=0.9995。

圖1 蘆丁標準曲線

取樣品液與對照品溶液同法顯色，在510 nm 波長處測其吸光度值［17-18］。將樣品液吸光度代入標準曲線方程中，求得樣品液中的總黃酮質量濃度C1。

1.2.3 總黃酮提取率計算公式

式中，C1為粗提液樣品中五葉草莓黃酮質量濃度，mg/mL;N為稀釋倍數，量綱為1;V1為粗提樣液總體積，mL;V2為測定時取樣體積，mL; M 為五葉草莓樣品質量，g。

1.2.4 總黃酮提取工藝優化

(1) 單因素試驗設計

設計單因素試驗，分別考察液料比(mL/g) (5 ∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1) 、超聲時間(15 min、20 min、25 min、30 min 和35 min) 、超聲溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃) 和乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%和90%) 這4 個單因素對五葉草莓黃酮提取率的影響。

(2) 響應曲面(Box-Behnken) 中心組合試驗設計

在單因素試驗基礎上，以五葉草莓黃酮提取率為響應值，進行Box-Behnken 的中心組合試驗，進一步考察液料比、超聲時間、超聲溫度及乙醇體積分數對總黃酮提取的影響，優化提取工藝。響應曲面試驗因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken 中心組合試驗設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 液料比對五葉草莓黃酮提取率的影響

液料比對五葉草莓黃酮提取率的影響如圖2 所示。

從圖2 可知，隨著液料比不斷加大，五葉草莓黃酮提取率呈先升后降趨勢，當液料比達到10∶1時，提取率達到最高。其原因可能是液料比達到10∶1時，五葉草莓黃酮已基本完全溶解在乙醇中，繼續增大液料比，并不利于五葉草莓黃酮的提取，故從提取效率、減少成本等方面綜合考慮，10∶1是合適的液料比。

圖2 液料比對五葉草莓黃酮提取率的影響

2.1.2 超聲時間對五葉草莓黃酮提取率的影響

超聲時間對五葉草莓黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 超聲時間對五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖3 可知，五葉草莓黃酮提取率在超聲時間為15 min ～25 min 內呈上升趨勢，當超聲時間達到25 min時，提取率最大，之后隨著超聲時間的延長，提取率卻呈下降趨勢。其原因可能是在超聲處理的前期，超聲波可有效破壞細胞壁，使活性成分黃酮類化合物釋放出來，但隨著時間的推移，持續的超聲產生大量的熱，使熱穩定性差的黃酮類物質被破壞而導致提取率下降，故超聲時間選取25 min 為宜。

2.1.3 超聲溫度對五葉草莓黃酮提取率的影響

超聲溫度對五葉草莓黃酮提取率的影響如圖4所示。

圖4 超聲溫度對五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖4 可以知，五葉草莓黃酮提取率在超聲溫度為40 ℃～60 ℃內緩慢上升，60 ℃時提取率達到最大，當超聲溫度超過60 ℃，提取率急劇下降。其原因可能是黃酮類化合物熱穩定性較差，但當溫度上升到一定值以后，會對其結構造成破壞，從而影響了五葉草莓黃酮提取率。所以，選擇60 ℃為合適的超聲溫度。

2.1.4 乙醇體積分數對五葉草莓黃酮提取率的影響

乙醇體積分數對五葉草莓黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 乙醇體積分數對五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖5 可知，在乙醇體積分數為50% ～60%范圍內時，五葉草莓黃酮提取率隨乙醇體積分數的增大而顯著上升，乙醇體積分數為60 %時提取率最大，之后提取率開始下降，當乙醇體積分數超過70%以后，提取率又有所上升。其原因可能是黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小部分以游離態苷元形式存在，乙醇溶液與五葉草莓黃酮均屬于極性物質，乙醇使黃酮易于被游離提取出來，但乙醇體積分數過大可能引起溶出的雜質增多，引起黃酮提取率下降［7，19］。所以，確定60%為合適的乙醇體積分數。

2.2 響應面分析法結果分析

在單因素試驗的基礎上，選取液料比(X1) 、超聲時間(X2) 、超聲溫度(X3) 及乙醇體積分數(X4) 4 個因素為變量，以五葉草莓黃酮提取率為響應值，采用Box-Behnken中心組合設計進行了四因素三水平試驗(表1) ，試驗結果及方差分析結果分別見表2 和表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果

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表3 Box-Behnken 試驗方差分析

采用Design Expert10 軟件對表2 和表3 中的試驗結果進行擬合分析，得到黃酮提取工藝參數回歸模型，其回歸方程為:

從表3 可知，黃酮提取工藝參數回歸模型的P 值小于0.0001，達到極顯著水平(P ＜0.01) ，且失擬項P 值=0.1618(＞0.05) ，不顯著，決定系數R2=0.9748，表明無失擬因素存在，方程與試驗擬合度較好，可用于五葉草莓黃酮提取的分析與預測?；貧w方程各項方差分析表明，4 個影響因素對五葉草莓黃酮類物質提取率影響的大小順序依次為:液料比＞乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間，且方程一次項(X1、X3、X4) 、二次項和交互項(X1X3) 的影響都是極顯著的(P ＜0.01) ，一次項(X2) 和交互項(X1X2、X1X4、X2X3)的影響都是顯著的(P ＜0.05) ，其余兩項為不顯著。

各因素兩兩交互作用對黃酮提取率影響的3D 響應曲面圖如圖6 所示。響應面坡度越陡峭且等高線越接近橢圓形，說明因素之間交互作用越明顯，對五葉草莓黃酮提取的影響也越大，相反則表明因素間交互作用不明顯，對五葉草莓黃酮提取率的影響較?。?0-21］。

從圖6 可知，液料比和超聲溫度兩因素之間的響應面坡度最陡，交互作用極顯著;液料比和超聲溫度、液料比和乙醇體積分數、超聲時間和超聲溫度等兩因素之間的響應面坡度陡峭且等高線趨于橢圓形，交互作用顯著;超聲溫度和乙醇體積分數兩因素之間響應面坡度比較平坦，交互不顯著。上述結果與回歸方程方差分析結果一致。

根據回歸模型最優組合分析，優化的提取工藝參數為:液料比12 ∶1(mL/g) 、超聲時間27 min、超聲溫度59 ℃、乙醇體積分數61%，其五葉草莓總黃酮提取率預測值為10.80 mg/g。以上述最優工藝組合進行五葉草莓黃酮提取，實際測得的黃酮提取率為10.68 mg/g，與模型理論預測值(10.80 mg/g) 之間的相對誤差僅為1.12%，說明采用二次通用旋轉組合設計優化得到的五葉草莓黃酮提取工藝參數準確可靠，可用于實際生產。

圖6 各因素交互作用對黃酮提取率的影響

3 結 論

以野生五葉草莓為研究對象，采用Box-Behnken 中心組合設計優化五葉草莓總黃酮的提取工藝，研究結果發現:

(1) 五葉草莓總黃酮的最佳提取工藝為: 液料比12∶1(mL/g) 、超聲時間27 min、超聲溫度59 ℃、乙醇體積分數61%。

(2 在最佳提取工藝條件下，五葉草莓總黃酮提取率實際可達10.68 mg/g，而傳統水浴回流法提取普通草莓黃酮的得率為5.13 mg/g［22］，說明超聲波輔助醇提法提取得率為傳統法的2.1 倍，且該方法操作簡單，重復性好。研究結果可為五葉草莓總黃酮物質的深度開發利用提供參考。