電針百會 大椎穴對高脂喂養(yǎng)AD兔模型腦組織代謝的影響

金平 潘永明 潘智勇 林敏 佟雅涵 許茂盛

阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征是進行性的記憶力減退和認知功能障礙，患者最終多因并發(fā)癥死亡［1］。雖然研究人員不斷嘗試研究新的藥物以達到緩解、治愈AD，但在過去的15年里仍無有效的新藥面世。2017年9月至2018年8月作者通過高膽固醇飲食喂養(yǎng)建立兔AD模型，探討電針“百會”、“大椎”穴對高脂喂養(yǎng)兔AD模型腦組織代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 取普通級3個月齡雄性日本大耳白兔（JWR）18只，體重2.0kg，隨機分成3組：（1）AD組6只：利用2%膽固醇飲食喂養(yǎng)12周建立AD模型；（2）正常對照組6只（normal control，NC）：給予正常基礎(chǔ)飲食喂養(yǎng)12周；（3）電針組6只（electro acupuncture，EA）：喂食方法同AD模型組，并同時給予電針治療。所有兔子 均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級兔實驗室，明暗交替（12h/12h），室內(nèi)溫度維持18℃～22℃，相對濕度維持40%～60%，所有實驗動物使用均符合3 R原則。根據(jù)中國針灸學會實驗針灸研究會1992年制定的《實驗動物穴位標準》選用“百會”、“大椎”穴，針具采用0.25mm×25mm的華佗牌不銹鋼毫針（蘇州醫(yī)療用品有限公司），電針治療采用韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），刺激參數(shù)為2/100Hz 疏密波，電流為（2±1）mA，持續(xù)時間30min，1次/d，5次/周，周末休息。

1.2 頭顱MR掃描 實驗兔禁食不禁水12h后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，將實驗兔以臥位固定并將頭頸部放入動物專用線圈位置中，確保兔保持呼吸順暢和心跳平穩(wěn)。采用3.0T磁共振成像系統(tǒng)（GE Discovery MR750），配備兔腦專用線圈（上海晨光公司）。主要MR掃描序列包括：軸位/冠狀位/矢狀位T2WI及1H MRS。MRS掃描用點分辨波譜分析法（PRESS），水抑制法采集信號，TR=2000ms，TE=35ms，層厚=3mm，掃描層數(shù)128，NEX 8。MR掃描儀自動進行預(yù)掃描，勻場，使水峰的半高全寬＜20Hz，水抑制＞95%。MRS的體素的位置根據(jù)獲得的軸位/冠狀位/矢狀位T2W圖像確定，體素9mm×16mm×9mm，主要包括雙側(cè)的大部分海馬、部分皮質(zhì)和丘腦（見圖1）。

圖1 MRS定位示意圖

1.3 MRS圖像后期處理及分析 腦內(nèi)代謝物的計算：利用 LC Model軟件（Version 6.3，Provencher SW）對MRS原始數(shù)據(jù)進行分析，生成MRS譜線（見圖2）并自動獲得包括N-乙酰天冬氨酸/肌酸（NAA/Cr）、谷氨酸 /肌酸（Glu/Cr）、膽堿 /肌酸（Cho/Cr）、肌醇 /肌酸（mI/Cr）在內(nèi)的具有重要生理或病理生理意義的神經(jīng)代謝化合物濃度比。

1.4 兔腦海馬的Aβ1-42蛋白的測量 經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）進行麻醉，處死后取腦，分離出海馬。使用IKA ULTRA-TURRAX勻漿機（IKAR-werke Gmbh & Co.，KG）制備10%的海馬組織勻漿，4℃離心10min（4500r/min），后取上清液，測量海馬Aβ1-42濃度水平，測量時使用來自南京建成生物工程研究所的ELISA試劑盒，測量過程嚴格按照該試劑盒說明書進行。

圖2 MRS譜線

圖3 三組兔MRS結(jié)果比較，? P＜0．05

1.5 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件。計量資料用（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兔腦內(nèi)代謝物組間差異 AD組NAA/Cr（0.66±0.07）較NC組（0.81±0.08）和EA組（0.78±0.07）明 顯 減 低（P＜0.05），NC組 NAA/Cr與 EA 組 NAA/Cr差異無統(tǒng)計學意義。AD組Glu/Cr（0.64±0.06）較NC組（0.87±0.06）和EA組（0.78±0.09）明顯減低（P＜0.05）；對照組Glu/Cr與電針組Glu/Cr差異無統(tǒng)計學意義。NC組（0.89±0.24）、AD組（0.92±0.14）及EA組（1.01±0.18）三組間MI/Cr差異無統(tǒng)計學意義；NC組（0.42±0.03）、AD組（0.44±0.03） 及 EA組（0.44±0.05）三組間（Cho/Cr）差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 兔腦海馬的Aβ1-42蛋白濃度 AD組兔海馬的Aβ1-42的表達（238.62±58.16）pg/mg、明顯高于NC組（155.57±26.17）pg/mg及EA組（166.38±30.92）pg/mg，差異有統(tǒng)計學意義（見圖4）。

圖4 三組兔腦海馬Aβ1-42濃度比較，?P＜0．05

3 討論

Aβ的異常聚集和沉積是AD發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)［2］。高膽固醇血癥可促進Aβ在腦內(nèi)的沉積，在AD的發(fā)病中起著重要的作用［3］。AD的臨床表現(xiàn)在中醫(yī)癥候中歸于“癲證”、“呆病”等范疇。百會和大椎均是手足三陽經(jīng)與督脈的交會之穴。基礎(chǔ)研究顯示針刺百會和大椎穴能顯著提高AD大鼠的學習與記憶能力［4］，本研究旨在基于這些研究的基礎(chǔ)上，利用1H-MRS技術(shù)從腦內(nèi)代謝物濃度改變的角度對電針百會、大椎治療AD的效果進行探討。

1H-MRS可以無創(chuàng)測量 NAA/Cr、Glu/Cr、mI/Cr、和Cho/Cr等用于評估神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嚴重程度［5］。NAA主要在神經(jīng)元線粒體內(nèi)合成，存在于神經(jīng)元細胞及其軸突內(nèi)，被認為是代表神經(jīng)元功能和密度的生物標志物，研究認為NAA與神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝密切相關(guān)［6］，其水平的降低可作為判斷神經(jīng)元丟失和損傷的可靠指標［7］。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性遞質(zhì)，是哺乳動物腦內(nèi)含量最高的氨基酸。Glu水平下降可反映谷氨酸能神經(jīng)元喪失，或Glu 能神經(jīng)元活性降低［8］。

關(guān)于AD患者的腦代謝MRS研究發(fā)現(xiàn)AD患者NAA、Glu濃度較正常對照組減低，是AD患者典型的腦MRS表現(xiàn)特征［9-10］；而AD患者與對照組MI、Cho的濃度差異各研究結(jié)果尚不統(tǒng)一［11-14］。本研究中，AD組NAA/Cr和Glu/Cr較NC組明顯減低，與AD的MRS表現(xiàn)相符，提示利用高膽固醇飲食成功誘導(dǎo)日本大白兔AD模型。本研究中EA組兔海馬的Aβ1-42明顯低于AD組，NAA/Cr和Glu/Cr水平明顯高于AD組，差異均有統(tǒng)計學意義。此外，EA組兔海馬Aβ蛋白濃度也明顯低于AD組，提示電針能減緩高脂喂養(yǎng)AD模型兔腦組織內(nèi)神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，電針百會、大椎穴能減緩高脂喂養(yǎng)AD模型兔腦組織代謝AD樣改變的進程，為電針有效治療AD提供腦組織代謝方面的依據(jù)。