青蒿琥酯增強順鉑對前列腺癌細胞殺傷活性及作用機制研究

周麗娜

前列腺癌嚴重威脅男性健康。盡管手術是治療前列腺癌的最佳手段，但對于進行術后輔助治療或中晚期前列腺癌患者而言，系統性化療仍是不可或缺的治療方案[1]。然而，一些腫瘤細胞對化療敏感性的降低是目前面臨的重大問題。順鉑是一種常見的鉑類化療藥物，其抗癌譜十分廣泛。腫瘤細胞攝入順鉑后，腫瘤細胞中DNA 會與順鉑發生不可逆性交聯反應，從而使其受損并喪失正常功能，進而誘導腫瘤細胞發生凋亡性死亡[2-3]。然而長期大劑量使用順鉑會嚴重降低腫瘤細胞對順鉑的敏感性，并對患者造成嚴重的副反應。因此，采用適當的輔助治療提高順鉑的抗前列腺癌活性以降低順鉑的使用劑量具有十分重要的臨床意義。本研究觀察體外聯用青蒿琥酯對順鉑抗前列腺癌活性的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人前列腺癌細胞系LNCaP 購于美國模式培養物保存中心（ATCC）。細胞培養在RPMI-1640 培養基（含10%胎牛血清）中，放置于37℃恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。

1.2 試 劑 順鉑（批號C2210000），青蒿琥酯（批號A3731），噻唑藍（MTT，批號M2128）和凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）購于德國Sigma-Aldrich。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號#5174）、間質表皮轉化蛋白（Met，批號#8198）、蛋白激酶B（AKT，批號#4691）、磷酸化AKT（批號#4060）、Bcl-2 相關細胞死亡激動子（Bad，批號#9268）、磷酸化Bad（批號#5284）、B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，批號#4223）、大分子B 淋巴細胞瘤蛋白（Bcl-xl，批號#2764）、半胱天冬酶-9（caspase-9，批號#9502）和半胱天冬酶-3 （caspase-3，批號#9665） 抗體購于美國Cell Signaling。增強化學發光底物（ECL）顯色試劑盒（批號32106）購于美國Pierce。脂質體2000（Lipofectamine2000，批號11668019）購于美國Invitrogen。蛋白G 免疫共沉淀瓊脂糖（批號sc-500778）購于美國Santa Cruz。

1.3 Met 真核表達載體構建及轉染 采用重組質粒轉染的方法進行Met 過表達，將人Met 基因開放閱讀框架序列用PCR 擴增，將擴增后的基因片段以分子克隆方法與pcDNA3.1 連接后構建成Met 重組過表達質粒。順時轉染簡要步驟如下：將2μg/mL Met重組質粒或空質粒用脂質體2000 進行包裹，靜置15min 后將其與無血清培養基混合。貼壁培養的腫瘤細胞用該包含質粒的培養基繼續孵育6h。隨后吸走該包含質粒的培養基，加入新鮮的RPMI-1640 培養基（含10%胎牛血清）常規培養24h，收集細胞用于后續實驗。

1.4 細胞活力抑制率檢測 按5×103/孔在96 孔板上接種LNCaP 細胞并孵育過夜，用于進行分組實驗。實驗分為對照組、青蒿琥酯組、順鉑組、順鉑+青蒿琥酯組和順鉑+青蒿琥酯+Met 質粒組。對照組為空質粒轉染的LNCaP 細胞不加藥物處理，青蒿琥酯組為空質粒轉染的LNCaP 細胞用10μM 青蒿琥酯處理，順鉑組為空質粒轉染的LNCaP 細胞用2μM 順鉑，順鉑+青蒿琥酯組為空質粒轉染的LNCaP 細胞用2μM 順鉑和10μM 青蒿琥酯聯合處理，順鉑+青蒿琥酯+Met 質粒組為Met 質粒轉染的LNCaP 細胞用2μM 順鉑和10μM 青蒿琥酯聯合處理。各組細胞培養48h 后，加入20μL MTT 溶液（5mg/mL）并繼續培養4h。吸走上清液，加入二甲亞砜，充分震蕩后用酶標儀檢測其吸光度（570nm 波長）。LNCaP 的細胞活力抑制率用以下公式計算：細胞活力抑制率=（吸光度對照組-吸光度藥物處理組）/吸光度對照組×100%。

1.5 免疫共沉淀 按1.4 所述進行分組處理LNCaP細胞，之后對LNCaP 細胞進行計數。將等量的各組細胞用細胞裂解液在冰上進行裂解，裂解30min 后將裂解產物離心10min（12000rpm）并采集上清液。將上清液分成等量兩份，一份用作內參（Input），另一份進行免疫共沉淀（IP）。在共沉淀體系中加入Bad 抗體并在4℃下孵育過夜，之后在共沉淀體系中加入蛋白G 瓊脂糖珠并在室溫搖床下作用2h。孵育完成后將該共沉淀產物離心5min（12000rpm）。之后吸走上清液，用Western blot 上樣緩沖液進行重懸并在沸水下浴煮5min。處理后的共沉淀體系可直接用于Western blot 實驗。

1.6 Western blot 試驗 直接提取的等量總蛋白質或1.5 所述所得樣品用10% SDS-PAGE 進行電泳分離。所得的蛋白分離膠再用電轉方法將其中的蛋白質轉移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉對PVDF 進行封閉孵育2h，再將PVDF 膜用GAPDH、Met、AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-9和caspase-3 抗體在4℃下孵育過夜。之后將該PVDF 膜用洗滌緩沖液清洗2 次后用帶辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育2h，用增強型化學發光底物（ECL）試劑盒檢測PVDF 膜上的蛋白條帶。目的蛋白的相對表達用目標蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J 軟件處理。

1.7 細胞凋亡試驗 按1.4 所述進行分組處理LNCaP 細胞，之后對LNCaP 細胞進行計數，取2×106的各組細胞按照凋亡檢測試劑盒說明書步驟用Annexin-V 和碘化丙啶（PI）對細胞進行染色孵育20min，之后用生理鹽水洗滌2 次，細胞用生理鹽水重懸后用流式細胞術檢測LNCaP 細胞Annexin-V的熒光強度。Annexin-V 陽性的LNCaP 細胞即為凋亡細胞。

1.8 統計學方法 實驗數據由3 次重復實驗而得，以均數±標準差（±s） 表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），統計分析軟件為SPSS 15.0，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 青蒿琥酯在體外增強順鉑對前列腺癌細胞殺傷活性 MTT 實驗結果顯示，順鉑+青蒿琥酯組LNCaP細胞活力抑制率、凋亡率均高于青蒿琥酯組和順鉑組（P 均＜0.05），見表1。

表1 青蒿琥酯和順鉑對LNCaP 細胞活力抑制率和凋亡率的影響（%，x±s）

2.2 青蒿琥酯通過下調Met 表達增強順鉑對前列腺癌細胞殺傷活性 Western blot 實驗結果顯示，青蒿琥酯能降低LNCaP 細胞Met 表達水平，順鉑對Met的表達水平無明顯影響。另外，轉染Met 表達質粒能使LNCaP 細胞Met 發生強制過表達，廢除青蒿琥酯對Met 的抑制，見圖1。同時，MTT 和流式細胞實驗結果顯示，青蒿琥酯+順鉑+Met 質粒組LNCaP 細胞活力抑制率和細胞凋亡率均低于順鉑+青蒿琥酯組（P＜0.05），見表1。

2.3 青蒿琥酯通過Met/AKT/Bad 途徑促進順鉑誘導的凋亡 免疫共沉淀實驗結果顯示，青蒿琥酯能明顯誘導LNCaP 細胞Bad 與Bcl-xl 及Bcl-2 相互作用，見圖2。同時，Western blot 實驗結果顯示，青蒿琥酯能明顯促進順鉑誘導的caspase-9 和caspase-3的活化，見圖3。然而，轉染Met 質粒后，青蒿琥酯聯合順鉑處理的LNCaP 細胞Bad 與Bcl-xl 及Bcl-2結合水平，caspase-9 和caspase-3 活化水平及凋亡水平均明顯降低，見圖2-3。

3 討 論

青蒿琥酯是提取自菊科植物黃花蒿葉的天然活性成分，除抗瘧作用外，還具有一定的抗腫瘤活性，能抑制一些腫瘤細胞增殖并阻滯其細胞周期[4-5]。然而，青蒿琥酯是否能提高順鉑對前列腺癌的殺傷活性，迄今還不明確。本實驗結果發現，盡管青蒿琥酯單獨處理對前列腺癌細胞系的殺傷活性較弱，但其能明顯增強順鉑的抗前列腺癌活性，表明青蒿琥酯可以作為輔助治療藥物增強前列腺癌細胞對順鉑的敏感性，提高其療效。

圖1 青蒿琥酯、順鉑和Met 質粒處理對LNCaP 細胞Met 表達水平及AKT 和Bad 磷酸化水平的影響

圖2 青蒿琥酯、順鉑和Met 質粒處理對LNCaP 細胞Bad 與Bcl-2 及Bcl-xl 相互作用的影響

圖3 青蒿琥酯、順鉑和Met 質粒處理對LNCaP 細胞caspase-9、caspase-3 活化水平的影響

Met 是肝細胞生長因子（HGF）的受體。文獻報道，高度活化的c-met 能促進腫瘤細胞的生長轉移并抑制其凋亡途徑，是一種原癌基因[6-9]。因此，Met 可作為腫瘤治療的潛在靶點。在Met 下游通路中，AKT的激活是Met 發揮腫瘤促進作用的重要步驟[10]。另外，Bcl-2 促凋亡蛋白Bad 是AKT 激酶的作用底物，然而Bad 的促凋亡活性取決于其磷酸化狀態。非磷酸化的Bad 能與Bcl-2 和Bcl-xl 這兩種抗凋亡蛋白發生結合，使其失去活性從而發揮促凋亡活性。然而，當Bad 被AKT 激酶磷酸化后，磷酸化的Bad 會從其與Bcl-xl 或Bcl-2 形成的異二聚體中分離出來，從而使Bcl-xl 和Bcl-2 游離出來發揮抗凋亡作用[11-12]。本研究結果還表明，青蒿琥酯能明顯抑制前列腺癌細胞Met 蛋白表達水平，從而抑制前列腺癌細胞AKT 磷酸化通路，使Bad 蛋白不能在AKT 激酶的作用下發生磷酸化，進而使Bcl-2 和Bcl-xl 蛋白失活以提高前列腺癌細胞對順鉑誘導的凋亡通路的敏感性，表現為凋亡執行蛋白caspase-9 和caspase-3 顯著活化，誘導前列腺癌細胞發生凋亡性死亡。總之，本研究結果顯示，青蒿琥酯可能通過Met/AKT/Bad 途徑增強順鉑的抗前列腺活性。