SIRT3、FOXO3a和E-cadherin在非小細胞肺癌中的相關性研究

田亮，郭楠，苗志剛，孔彥，李鯤鵬，張楠

（河北醫科大學附屬滄州市中心醫院，河北 滄州 0 6 1 0 0 0）

0 引言

肺癌是威脅全球人類健康的主要疾病之一，發病率和死亡率高，預后差。非小細胞肺癌（NSCLC）在肺癌中占比約85%～90%，與其它類型相比，對治療不敏感[1]。腫瘤侵襲和轉移是NSCLC主要的致死原因，然而，肺癌侵襲和轉移的分子機制還沒有定論[2]。很多研究認為上皮-間質轉化（EMT）在腫瘤侵襲和轉移過程中起重要作用。

去乙酰化酶家族成員（IRT3）與腫瘤的發生密切相關。SIRT3可通過調節FOXO3a和E-cadherin蛋白表達，來控制癌細胞EMT過程。叉頭框蛋白家族成員（FOXO3a）可抑制相關通路蛋白調節EMT。E-cadherin主要介導細胞間的黏附反應，是EMT過程中的關鍵因子[3]。本研究結合臨床病理資料，分別檢測SIRT3、FOXO3a和E-cadherin蛋白在非小細胞肺癌中的表達情況，探討在非小細胞肺癌中的相關性。

1 資料與方法

1.1 患者與組織標本

從2012年8月至2016年3月，收集130例滄州市中心醫院根治術標本，男性79例，女性51例，術前均未行任何放化療及靶向治療。所有切片按WHO肺癌分型標準進行復診[4]，其中鱗狀細胞癌38例、腺癌92例，高分化68例、中分化38例、低分化24例。TNM分期參照第8版國際抗癌聯盟[5]，Ⅰ/Ⅱ期46例、Ⅲ/Ⅳ期84例。每例患者包括腫瘤組織及對應的癌旁組織（距離＞5cm）。所有病人均有完整的隨訪資料。

1.2 免疫組化方法

采用SP方法，組織標本先經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，厚度4μm。使用抗體如下：多克隆抗體FOXO3a（兔抗，英國Abcam），多克隆抗體E-cadherin（鼠抗，中杉金橋），多克隆抗體SIRT3（鼠抗，美國Genetex）。

1.3 結果

SIRT3陽性定位于細胞漿/核，FOXO3a陽性定位于細胞核，E-cadherin陽性定位于細胞膜/漿。結果由兩位高年資病理醫師雙盲判定，參照標準：按陽性率，＜25%=0分、25%～75%=1分、＞75%=2分；按著強度，不著色=0分、弱=1分、中度=2分，強=3分；通過兩種評分之積來判定，值≥4判定為高表達，值＜3判定為低表達[6]。

1.4 統計學方法

所有數據用SPSS 16.0軟件進行分析，計數資料用率（%）表示，采用χ2檢驗，用Pearson方法分析不同指標變量的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三者在非小細胞肺癌和癌旁組織中的表達

SIRT3蛋白在細胞漿和細胞核內表達不一，主要位于胞漿，SIRT3在NSCLC中高表達，腺癌和鱗狀細胞癌陽性率均為100.0%（圖1、圖2），其中鱗狀細胞癌中表達尤為明顯，NSCLC陽性率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。FOXO3a在非小細胞肺癌中呈低表達，其中，鱗狀細胞癌表達率為10.5%（4/38），腺癌表達率為13.0%（12/92）（圖3）。而癌旁正常組織呈陽性表達，表達率為100.0%（130/130），FOXO3a蛋白在肺癌中明顯低于癌旁組織表達（P＜0.05）。E-cadherin在支氣管及肺泡上皮細胞中呈高表達（圖4），而在NSCLC中表達明顯呈低表達，腫瘤組織分化越低，陽性率越低。在癌旁正常組織中，E-cadherin表達率為88.5%（115/130），然而在NSCLC中呈低表達，其中，鱗狀細胞癌表達率為36.8%（14/38），腺癌表達率為59.8%（55/92），結果顯示，E-cadherin在肺癌中表達明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。

2.2 三者與臨床病理特征的關系

分析三者陽性率與NSCLC臨床病理資料間的關系發現：三者均與大小、分化級別、淋巴結和遠處轉移及TNM分期具有相關性（P＜0.05），而與性別、年齡和組織學類型無關（P＞0.05）

2.3 NSCLC組織中三者蛋白表達的相關性

免疫組化法檢測130例NSCLC腫瘤組織三者蛋白表達情況：同一NSCLC患者腫瘤組織SIRT3蛋白低表達，而FOXO3a和E-cadherin蛋白高表達。SIRT3與FOXO3a蛋白呈負相關（r=-0.682，P＜0.05），SIRT3與 E-cadherin蛋白呈負相關（r=-0.754，P＜0.05），FOXO3a與E-cadherin表達呈正相關（r=0.561，P＜0.05）。

2.4 NSCLC組織中三者蛋白表達與預后的相關性

對所有患者進行術后隨訪，SIRT3高表達患者生存率為38.15%，顯著低于低表達患者術后生存率69.81%，SIRT3表達越高，生存率越低。FOXO3a和E-cadherin在非小細胞肺癌中表達則相反，其表達越低，生存率越高。

圖1 鱗狀細胞癌組織中SIRT3細胞漿呈陽性表達（SP X10）

圖2 腺癌組織中SIRT3呈陽性表達（SP X10）

圖3 FOXO3a在腺癌組織中細胞核呈陽性表達（SP X10）

圖4 E-cadherin在癌旁正常組織中細胞膜呈陽性表達（SP X10）

3 討論

腫瘤發生和發展涉及多種生物學過程，腫瘤浸潤和轉移是患者死亡的主要原因，其中，上皮-間質轉化在腫瘤侵襲和轉移過程中發揮了重要作用，也與化療藥物耐藥相關，可以作為臨床判定治療后復發和轉移的一個指標。

SIRT3又稱線粒體去乙酰酶，定位于11號染色體，廣泛存在于各種生物體內，與機體腫瘤的發生及發展密切相關，也參與多種腫瘤的轉移過程。近年來，SIRT3與腫瘤浸潤和轉移相關性研究逐漸受到重視，王峰等[7]在乳腺癌組織中，采用免疫組織化學方法，并結合臨床病理資料及預后分析，得出SIRT3蛋白與乳腺癌的發生發展關系密切，SIRT3的高表達可能促進腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。高立明等[8]在胃癌組織中得出SIRT3在胃癌組織中的表達低于正常胃粘膜組織，提示SIRT3在胃癌的發生發展過程中可能起抑制作用。孫軍等[9]在非小細胞肺癌組織中得出SIRT3表達與病理組織分級有關，其表達與腫瘤分化呈負相關，而且與腫瘤分期有關。本文研究結果顯示，SIRT3蛋白在NSCLC組織中表達增高，而在癌旁正常組織中表達降低或陰性表達。與癌旁組織相比，SIRT3在癌組織的表達明顯增高，提示SIRT3可能促進NSCLC的發生。SIRT3表達與臨床分期和轉移呈正相關，SIRT3表達越高，預后越差，提示SIRT3具有臨床預后意義。

FOXO3a是一個抑癌基因，在許多腫瘤中表達降低。近幾年，FOXO3a與腫瘤上皮-間質轉化的相關研究逐年增多。NiD等[10]在透明細胞癌細胞株中，研究發現FOXO3a丟失，通過SNAIL1上調誘導腫瘤細胞EMT，促進腫瘤細胞轉移。Cheng CW等[11]在肺癌細胞株中研究認為缺氧誘導因子通過激活EMT增強細胞運動性，FOXO3a相關通路失活抑制HIF-1α，間接抑制EMT，從而阻礙腫瘤轉移。本研究發現FOXO3a蛋白在癌旁正常組織高表達，而在NSCLC組織中表達明顯降低，因此，FOXO3a在NSCLC中可能扮演了抑癌基因的角色，促進了NSCLC浸潤和轉移。

E-cadherin基因位于16q22.1，主要介導同種細胞間的黏附反應，其表達下降，能促進EMT進展，與肺腺癌浸潤性行為和不良預后相關[12]。陳鵬等[13]采用免疫組織化學方法，得出E-cadherin可能在非小細胞肺癌侵襲和轉移中發揮重要作用。本研究發現，NSCLC癌組織中E-cadherin呈低表達，在癌旁正常組織中高表達，E-cadherin缺失可能參與了NSCLC浸潤和轉移過程。

三者在其他腫瘤中的相關性研究也在進行，Li等[14]在前列腺癌細胞株中，通過體內和體外研究發現FOXO3a與SIRT3形成相互作用，SIRT3促進FOXO3a依賴基因轉錄，認為兩者共同參與了EMT，從而促進腫瘤浸潤和轉移。SIRT3可使上皮鈣粘素/連環素復合體表達減弱，在分解EMT過程中發揮了重要作用。郭存存等[15]在結直腸癌中研究認為FOX03a蛋白表達與wnt信號通路負性調節因子E-cadherin的表達呈正相關。提示FOX03a和E-cadherin可能共同參與了結直腸癌發生發展。本研究發現在NSCLC組織中，SIRT3表達與FOXO3a及E-cadherin表達均呈負相關，FOXO3a和E-cadherin表達越低，SIRT3表達越高。因而在非小細胞肺癌中，三者可能共同參與了腫瘤侵襲和轉移。

總之，腫瘤侵襲和轉移可能通過SIRT3介導Wnt信號通路，并通過FOX03a協同，三者共同促進NCSCLC腫瘤細胞發生和發展，因而檢測三者的表達有助于臨床判定預后，也有望成為非小細胞肺癌靶向治療新的靶點。