藍圓鲹酸/堿等電點沉淀法分離蛋白凝膠特性與消化特性

孫樂常，林怡晨，劉偉鋒，翁 凌，張凌晶，劉光明，曹敏杰,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

藍圓鲹（Decapterus maruadsi），鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），系暖水性中上層魚類，在中國、日本、朝鮮等國家周邊海域均有分布[1]。據統計，2016年藍圓鲹全國捕撈量總計達60.09萬 t，其中福建省捕撈量為27.67萬 t，居全國首位，且歷年產量趨于穩定，具有很好的開發利用前景[2]。目前，藍圓鲹除鮮食外，主要被加工成魚干、魚露或腌制品等低值產品，其精深加工產品比例較低[3]。另一方面，由于過度捕撈與氣候環境變化，全球的海洋魚類資源日益匱乏，一些傳統魚糜原料魚類產量，如鱈魚、鰻魚、馬鮫魚等，已呈現出逐年下降的趨勢，與當前我國魚糜制品需求量不斷攀升形成鮮明反差，尋找一種新的魚糜制品原料已成為沿海地區魚糜企業亟待解決的問題之一。價格低廉、產量穩定的藍圓鲹有望成為理想的魚糜制品新原料[4]。傳統魚糜加工過程中，往往需要通過漂洗以去除魚肉中的油脂、血液以及水溶性蛋白酶，從而達到增白、提高魚糜凝膠強度的目的。然而，漂洗同時也導致了大量水溶性蛋白流失，造成優質蛋白的嚴重浪費。

等電點沉淀技術是基于蛋白質在不同pH值的溶解特性衍生出的蛋白質分離技術。最初該分離技術廣泛應用于植物蛋白的分離與制備，能高效提取大豆分離蛋白且保持其生物活性[5]。相比于傳統魚糜制品加工過程中的魚肉漂洗法，該方法在回收小型低值海洋魚類蛋白方面具有以下優勢：魚蛋白的回收率顯著提高；可以有效去除魚肌肉中的脂肪成分，防止因油脂氧化而導致的魚糜品質下降[6]。因此，等電點沉淀法也漸漸應用于水產蛋白資源的開發與利用。目前的報道多集中于斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]、石首魚（Micropogon undulatus）[8]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）[10]、沙丁魚（Sardinella gibosa）[11]、鱈魚（Gadus morhua）[12]、鯡魚（Clupea harengus）[13]等少數魚類。以上研究發現，魚類的等電點沉淀分離蛋白所表現出的蛋白構象變化與凝膠特性不僅與pH值相關，也呈現出明顯的魚種差異性。等電點沉淀分離蛋白在經歷酸或堿性pH值變化時，會發生一系列構象的展開與折疊，這些變化可能會使其分子的結構、構象、物理化學特性等發生改變，并最終影響蛋白質的功能特性，如凝膠性、乳化性等[14]。此外，蛋白質構象的改變還可能影響其在人體內的消化與吸收，進而改變蛋白的營養價值。然而迄今為止，魚分離蛋白在等電點沉淀過程中結構變化規律和內在分子機制，以及分離蛋白在人體內的消化性變化仍未闡明[6]。

本研究擬以藍圓鲹為原材料，采用等電點沉淀法制備肌肉分離蛋白，優化蛋白質分離的條件，并系統比較分析酸法與堿法回收等電點沉淀分離蛋白的凝膠與消化特性，旨在為等電點沉淀技術在藍圓鲹分離蛋白中的應用及其工業化生產提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍圓鲹（均質量約150 g/尾）購于福建省廈門市集美菜市場。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）用標準蛋白 美國Thermo Fisher Scientific公司；豬胃蛋白酶（250 U/mg）、豬胰蛋白酶（1 500 U/mg）美國Sigma公司；氨基酸混合標準品H型 日本Wako公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC）美國Agilent公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PT-2100 E組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；UB-7pH計、MA35M-000230V1水分測定儀 德國Sartorius公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀設備有限公司；GF-1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Mini-PROTEAN蛋白質電泳裝置 美國Bio-Rad公司；G:BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司；TA.new plus質構儀 美國Isenso公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；Stephan UMC 5真空斬拌機 美國Stephan Machinery公司；E-1010離子濺射儀、S-480掃描電子顯微鏡 日本日立制造所；Samdri-PVT-3D臨界點干燥儀美國Tousimis公司。

1.3 方法

1.3.1 分離蛋白的制備

無特殊說明，所有操作均在4 ℃進行。新鮮藍圓鲹去皮采肉后，加入4 倍體積冰水用組織搗碎機充分搗碎。得到的肉漿用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節pH值至10.0～11.5或1.5～3.0，經過10 min的磁力攪拌（300 r/min）后，8 000×g離心10 min，小心去除表層白色漂浮狀物，并收集上清液組分，用1 mol/L的HCl溶液或NaOH溶液調節pH值至4.5～6.0，攪拌10 min后經過8 000×g離心10 min，收集沉淀部分，并加入一定量的NaHCO3調節pH值至7.0，即為分離蛋白。其中，利用在堿性pH值條件下溶解制備得到的分離蛋白為堿法分離蛋白（alkaline aided protein isolate，KPI），酸性pH值溶解制備得到的分離蛋白為酸法分離蛋白（acid aided protein isolate，API）。藍圓鲹采后的肌肉組分即為實驗中所用全蛋白（total protein，TP），肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的制備則參考Rawdkuen等[15]的方法。得到的4 種蛋白均放置于保鮮密封口袋中，于冰上保存，并在24 h內使用。

1.3.2 理化指標測定

利用水分自動測定儀測定水分含量，加熱溫度為160 ℃。脂肪、灰分以及粗蛋白含量測定參考Sun Lechang等[16]的方法進行測定，均以干質量計。

1.3.3 氨基酸成分分析

藍圓鲹分離蛋白的氨基酸成分分析參考孫莎[17]的方法進行。準確稱取0.01 g的蛋白質樣品，置于10 mm×100 mm真空消化管中，加入1 mL的6 mol/L HCl溶液，120 ℃油浴24 h。消化結束后用1 mol/L NaOH溶液調節pH值至中性。色譜條件：Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器：波長338 nm（OPA-氨基酸）和262 nm（FMOC-氨基酸）；A相為40 mmol/L Na2HPO4（pH 7.8）；B相為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；進樣量0.5 μL；流速2 mL/min；柱溫箱40 ℃。

1.3.4 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[18]方法對分離蛋白進行分析。將分離蛋白加入2 倍體積的蛋白質溶解液，95 ℃加熱20 min。蛋白質溶解液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）含1% SDS，8 mol/L尿素，體積分數2% β-巰基乙醇。

1.3.5 消化特性分析

1.3.5.1 體外模擬胃腸液消化

為探究4 種蛋白熱處理后的消化特性，分別將4 組蛋白以1∶4（g/mL）與純水均質混勻，經90 ℃加熱30 min后用于該部分實驗。

模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）參照文獻[19]的方法，配制質量濃度為2 g/L的NaCl溶液，并用HCl調節pH值至1.2。體外SGF消化參考萬楚君等[20]的方法，并做適當修改。整個SGF消化的總反應體系為3 mL，胃蛋白酶與蛋白的比例為1∶100（m/m）。取1.5 mL SGF加入試管中，于37 ℃預熱15 min，再與加熱處理后的蛋白樣品混勻，隨后加入胃蛋白酶，于37 ℃水浴鍋中振蕩反應0、5、10、30、60、120 min。在達到反應時間后，取出200 μL反應液于1.5 mL離心管中，加入60 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應。對照組的反應除不加蛋白酶外，步驟與樣品組一致。

模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）參照文獻[19]配制50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）。SIF消化實驗參考萬楚君等[20]的方法并作適當修改，其總反應體系為3 mL，豬胰蛋白酶與蛋白的比例為1∶600（m/m）。在試管中加入1.5 mL SIF于37 ℃預熱15 min，再將加熱處理后的蛋白加入試管中混勻，于37 ℃水浴鍋中振蕩反應0、5、10、30、60、120 min。達到反應時間后，取出200 μL反應液于1.5 mL離心管中，95 ℃加熱10 min終止反應。對照組的反應除不加蛋白酶外，步驟與樣品組一致。

蛋白的體外模擬胃腸液消化（連續消化）實驗，SGF與SIF同上述一致。主要步驟如下：200 μL樣品在經過120 min SGF消化后，迅速加入60 μL 0.2 mol/L Na2CO3調pH值為7.0后，再加入200 μL預熱的SIF與豬胰蛋白酶，于37 ℃水浴振蕩反應120 min，隨后置于95 ℃加熱10 min滅活，即得到模擬胃腸液消化樣品。

1.3.5.2 酶解樣品中可溶性肽含量測定

采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性肽含量測定法評價蛋白的體外模擬消化效果。在得到的消化樣品中加入30% TCA使其最終為5%，繼續補加5% TCA定容至1 mL，經充分的振蕩混勻后，8 000×g離心10 min，取上清液部分。上清液中可溶性肽含量根據Lowry法[21]進行測定，以酪氨酸（Tyr）為標準，以每克蛋白釋放的Tyr物質的量表示（μmol/g）[22]。

1.3.6 凝膠特性分析

1.3.6.1 分離蛋白魚糜凝膠的制備

參考Klomklao等[22]的方法進行制備。用冰水調節藍圓鲹分離蛋白的含水量至85%，其后放入真空斬拌機中低溫空擂10 min，再加入分離蛋白質量分數2%的NaCl繼續斬拌10 min。將擂潰后的樣品分為兩部分：一部分裝于圓柱形模具（直徑3.5 cm，高4.5 cm）中，兩端密封扎緊，用于凝膠質構測定實驗；另一部分用于動態流變學分析。分離蛋白魚糜凝膠化采用2 種加熱方式，一種是正常凝膠化加熱（kamaboko組），即40 ℃加熱30 min后90 ℃加熱30 min；另一種是模擬凝膠劣化加熱（modori組），即55 ℃加熱30 min后90 ℃加熱30 min。加熱后獲得的凝膠樣品立刻置于冰水混合物中迅速冷卻并于4 ℃過夜后待測凝膠強度。

1.3.6.2 動態流變學分析

參考Abdollahi等[23]的方法對藍圓鲹分離蛋白的流變學特性進行研究。采用40 mm平行鋁板，取上述流變待測樣品（1.5～2 g），均勻平鋪在測試平臺上，除去周圍過量的樣品，在四周裸露部分涂上少量的石蠟密封，避免水分蒸發。具體參數如下：樣品間隙1.5 mm，應變為1%，掃描頻率為1 Hz，掃描溫度為10～90 ℃，掃描速率2 ℃/min。

1.3.6.3 凝膠強度測定

參考Weng Wuyin等[24]的方法利用質構儀測定魚糜凝膠樣品的凝膠強度。測定前將樣品切成高為3 cm左右的圓柱體。質構分析具體參數：探頭為5 mm直徑球形探頭，測試速率0.5 mm/s，觸發力5 g，形變程度50%。數據分析曲線上的第1個峰值即為破斷力，其對應的穿刺距離即為破斷距離。按下式計算凝膠強度：

凝膠強度/（N·mm）= B×D

式中：B為魚糜制品的破斷力/N；D為魚糜制品的破斷距離/mm。

1.3.6.4 微觀結構分析

參考Weng Wuyiin等[24]的方法，利用掃描電子顯微鏡觀察魚糜樣品的微觀結構。先將樣品切成2～3 mm的小塊，用固定液（2.5%戊二醛，0.1 mol/L PBS，pH 7.2）在4 ℃條件下浸泡24 h后，用pH 7.2、0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3 次，再進行體積分數30%～100%乙醇溶液梯度脫水，CO2臨界干燥后將樣品通過導電膠固定值樣品臺上。經E-1010離子濺射儀鍍金后，在10 kV的加速電壓下觀察魚糜樣品的微觀結構。

1.4 數據分析

所有實驗均至少重復3 次以上。采用Microsoft Excel 2013軟件進行數據處理求平均值、偏差；采用SPSS 17.0軟件進行顯著性差異分析（Duncan多重檢驗，P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 酸/堿等電點沉淀法制備分離蛋白的條件優化

圖1 pH值對藍圓鲹蛋白溶解性與回收率的影響Fig. 1 Effect of pH on the solubility and recovery yield of blue round scad protein

本研究中，藍圓鲹肌肉蛋白在pH 1.5～12.0范圍內的溶解度呈現出典型的U型溶解曲線，蛋白質在酸/堿兩端的溶解度最高，如圖1a所示。其中，在酸性pH值范圍內，肌肉蛋白溶解度在pH 2.0以后趨于穩定，pH 2.0時溶解度達到最高值，蛋白質量濃度達0.52 mg/mL，溶解度為81.2%；在堿性pH值范圍內，肌肉蛋白溶解度在pH 10.0以后逐漸趨向穩定，蛋白質量濃度達0.63 mg/mL，溶解度可達95%以上，顯著高于酸性pH值。此外，肌肉蛋白在pH 4.5～5.5范圍內的溶解度較低，當pH值為5.5時達到最低值（10.2%）。Undeland等[13]研究了鯡魚白色肉在不同pH值范圍的溶解度時發現，肌肉蛋白在pH值小于4.0或大于11.0時均能有90%以上的溶解度，蛋白在pH 5.5～6.0時的溶解度最小，類似結果還見于斑點叉尾鮰[7]、石首魚[8]、鯉魚[25]、羅非魚[9]等，以上結果與本研究中藍圓鲹肌肉蛋白在不同pH值條件下的溶解性變化規律一致。

由于蛋白在pH 11.0處的溶解度與pH 12.0相差不大，基于實際應用中原料與成本考慮，選擇pH 11.0為本次實驗堿法制備分離蛋白的最優溶解pH值。在此基礎上，本研究選取最優的pH 2.0與pH 11.0的蛋白質溶解條件，并觀察等電點沉淀pH值下的分離蛋白回收率情況，結果如圖1b所示。通過酸法與堿法溶解的蛋白溶液，在沉淀pH值為5.5時等電點沉淀得到的分離蛋白回收率均最高，分別為65.0%與84.6%，且堿法溶解的分離蛋白回收率顯著高于酸法溶解的，這可能與肌肉蛋白本身在酸性pH值下的溶解較低有關。Kristinsson等[7]發現斑點叉尾鮰與石首魚[8]肌肉蛋白在酸法等電點沉淀的回收率高于堿法等電點沉淀。而羅非魚[9]以及歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）[26]肌肉蛋白在堿法等電點沉淀下的回收率則高于酸法。本研究的結果與Tian Yuanyong等[25]對鯉魚肌肉蛋白的回收率研究結果一致。酸/堿等電點沉淀的回收率與魚的種類、肌肉蛋白的類型和含量有著明顯地相關性。

2.2 理化指標測定結果

表1 藍圓鲹分離蛋白理化指標Table 1 Proximate composition of blue round scad protein isolates%

由表1可知，藍圓鲹全肉的粗蛋白、脂肪與灰分的質量分數分別為79.6%、13.0%、5.8%，與陳曉婷等[3]對藍圓鲹肌肉組成分析的結果接近。迴游性海洋魚類肌肉的脂肪中含有大量的不飽和脂肪酸，在加工與貯藏過程往往會發生脂肪過氧化現象，導致魚肉品質的下降。因此，在制備分離蛋白時，分離蛋白中脂肪的脫除率也是評價分離方法實際應用效果的重要指標之一[27]。與TP相比，MP與等電點沉淀（API/KPI）均可有效降低魚肉中的脂肪與灰分含量，其中KPI去除脂肪效果最佳，脫除率達到59.2%。堿法等電點沉淀在脫脂上優于酸法在其他魚類肌肉蛋白回收中亦有報道，如：彩虹鮭魚（Oncorhynchus mykiss）[27]、石首魚[8]、斑點叉尾鮰[7]等，推測其可能是由于油脂與堿發生皂化，生成的脂肪酸鹽在離心后會浮于上清液表層從而能被輕易去除。此外，相比于API（80.5%），KPI（87.1%）的粗蛋白質量分數也顯著高于TP（79.6%）和MP（77.9%），表明堿法等電點沉淀技術更適用于藍圓鲹肌肉蛋白分離。

2.3 SDS-PAGE分析

魚類肌肉蛋白按其溶解特性可分為水溶性的肌漿蛋白、鹽溶性的MP以及不溶性的基質蛋白，肌漿蛋白與MP分別占總蛋白的20%～50%與50%～70%，基質蛋白含量最低，在10%以下[28]。利用SDS-PAGE對得到的4 種蛋白（TP、MP、API與KPI）的蛋白組成進行分析，如圖2所示，4 種分離蛋白的主要蛋白組成接近，包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、肌動蛋白（actin，AC）、肌鈣蛋白T（troponin-T，TN-T）以及原肌球蛋白（tropomyosin，TM），且MHC含量都是最高。但與其他3 組分離蛋白（TP、AP、KPI）不同，MP組在40～150 kDa區間的蛋白條帶明顯比較少，這可能由于等電點沉淀法回收了水溶性和鹽溶性的蛋白，而MP制備過程水溶性蛋白被除去。Rawdkuen等[15]對比羅非魚肌肉不同分離蛋白時得到類似的實驗結果。此外，API組在150～200 kDa區間出現了較多的降解片段，推測其原因可能是MHC在酸性pH值下發生了部分降解，這種現象與Tian Yuanyong等[25]研究鯉魚肌肉分離蛋白的結果一致。

圖2 藍圓鲹魚肉分離蛋白的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE patterns of blue round scad protein isolates

2.4 氨基酸成分分析

表2 藍圓鲹分離蛋白氨基酸含量分析Table 2 Amino acid conposition of blue round scad protein isolates%

為進一步比較分離蛋白的營養價值變化情況，對其進行氨基酸組成分析，如表2所示。4 組分離蛋白的氨基酸組成基本一致，蛋白中的谷氨酸鹽（谷氨酸＋谷氨酰胺，Glu＋Gln）含量最高，其次為天冬氨酸鹽（天冬氨酸＋天冬酰胺，Asp＋Asn）、亮氨酸（Leu）與賴氨酸（Lys）。除色氨酸因為鹽酸水解被完全破壞未檢出外，藍圓鲹肌肉4 組蛋白的必需氨基酸與總氨基酸比例均高于40%，滿足FAO/WHO推薦的理想蛋白模式，屬于優質蛋白，這個結果與楊伊然等[29]對藍圓鲹魚肉蛋白氨基酸分析結果一致。

此外，API與KPI的甘氨酸（Gly）與脯氨酸（Pro）含量明顯低于TP與MP（P＜0.05），其原因可能由于大部分基質蛋白在酸或堿性條件下溶解性較低，可通過離心去除。而甘氨酸與脯氨酸是基質蛋白的主要組成氨基酸，因此在API與KPI中的含量較低。本研究的結果與Tian Yuanyong等[25]的研究結果相一致。

2.5 凝膠特性分析

圖3 藍圓鲹分離蛋白凝膠強度Fig. 3 Gel strength of blue round scad protein isolates

如圖3所示，在kamaboko組，凝膠強度由高至低分別為MP（63.6 N·mm）＞TP（23.5 N·mm）＞API（12.4 N·mm）＞KPI（2.1 N·mm）。相比之下，經過55 ℃模擬凝膠劣化加熱后，4 組蛋白的凝膠強度由高至低分別為MP（24.5 N·mm）＞API（10.3 N·mm）＞TP（3.8 N·mm）＞KPI（1.9 N·mm），低于kamaboko組中相應魚糜制品的凝膠強度，這可能與內源性蛋白酶導致的凝膠劣化有關[30-31]。此外，kamaboko組和modori組中API和KPI均表現比MP低的凝膠強度，特別是KPI的凝膠強度最弱，可能是由于KPI相比于MP含有更多的水溶性蛋白酶[32]。API組在2 種加熱方式所測定的凝膠強度并無明顯差別，表明內源性蛋白酶在酸法等電點沉淀過程發生了不可逆變性失活。

如圖4所示，除API組外，TP、MP和KPI在50～55 ℃出現儲能模量（G’）下降的趨勢，表明發生了凝膠劣化現象，這與55 ℃加熱條件下3 組蛋白魚糜凝膠強度的下降相吻合。從55 ℃開始，TP、MP和KPI的儲能模量出現明顯的上升趨勢，暗示著發生了典型的魚糜凝膠化現象[33]。API組沒有表現明顯的凝膠化和凝膠劣化現象，推測可能在酸法等電點沉淀過程中肌肉蛋白發生了劇烈的蛋白變性現象，導致包括肌球蛋白發生了不可逆變性，從而失去熱凝膠能力。有研究指出魚糜凝膠的形成是由于內部的蛋白質分子間或分子內通過二硫鍵、氫鍵、疏水互作等作用力發生交聯，從而形成了三維網絡結構，而在加熱前已經變性的蛋白質則無交聯能力，進而無法形成凝膠[34]。肌球蛋白作為魚糜凝膠形成的關鍵蛋白，它的變性程度對魚糜的凝膠形成起著決定性作用。Kristinsson等[12]研究發現在低pH值下肌球蛋白會發生完全的解離，而在pH 11.0下則能夠保持相對較高的結構完整性；Park等[11]研究沙丁魚肌球蛋白在不同pH值條件下的變化中發現，沙丁魚肌球蛋白在pH 2.0溶解后，再將pH值調回中性會發生完全的蛋白變性，進而導致蛋白的凝膠形成能力顯著下降。這些報道與本研究中所做的推測相符。此外，酸性條件不僅使肌球蛋白發生變性，還會使其他內源性蛋白酶變性失活[16]，這可能是API在2 種加熱方式下凝膠強度并未明顯差異的原因。

圖4 藍圓鲹魚肉分離蛋白流變學分析Fig. 4 Rheological analysis of blue round scad protein isolates

圖5 藍圓鲹魚肉分離蛋白凝膠微觀結構Fig. 5 Microstructure of blue round scad protein isolates

如圖5所示，kamaboko組中TP與MP凝膠表層更加致密，這與其內源性谷氨酰胺轉氨酶的交聯作用有關。劉海梅[35]發現添加了微生物谷氨酰胺氨酶（MTGase）的鰱魚魚糜微觀結構比未添加的對照組更致密平整。Abdollahi等[10]在研究黑海小鯡魚（Clupeonella cultriventris）與鰱魚肌肉分離蛋白凝膠特性時，亦得到與本研究類似的微觀結構。此外，掃描電子顯微鏡中使用的發射電子束強度大小也可能影響凝膠微觀形態表征情況，如使用20.0 kV的電子束可以觀測到沙丁魚魚糜的多孔狀凝膠結構[36]，而使用了10.0 kV或15.0 kV觀測時，則很難看到鰱魚魚糜凝膠的網孔狀結構[35]。

另一方面，KPI、TP與MP在modori組得到的凝膠結構與kamaboko組相比，更加疏松多孔，這可能與KPI、TP與MP中能存在的內源性蛋白酶有關。該結果與本研究中各組蛋白的質構及流變學分析的結果一致。

2.6 藍圓鲹分離蛋白的消化特性分析

蛋白質結構的改變可能引起酶解特性的變化，在食物中則反映在蛋白質的消化特性上。本研究將制備的2 種分離蛋白（API和KPI）與TP以及MP進行了90 ℃的熱處理，通過體外模擬胃腸液消化實驗對其消化特性進行比較分析。如圖6所示，胃蛋白酶對于4 種加熱蛋白的酶解活性從高到低依次為MP＞KPI＞API＞TP，其在胃蛋白酶水解120 min時釋放的可溶性肽含量分別為267.4、207.9、189.7、19.4 μmol/g，MP的消化性最好，KPI與API的消化性略低于MP，TP則表現出強烈的耐消化性。相比之下，4 種加熱蛋白都能較好地被胰蛋白酶酶解，其酶解活性從高到低依次為MP＞TP＞API＞KPI，這可能與胰蛋白酶較多的底物催化位點有關。通過連續模擬體外胃腸液消化，結果顯示MP、KPI與API的蛋白消化性明顯優于TP。綜合蛋白的回收率，本研究所制備的分離蛋白KPI與API有回收率高、消化性好的特點，具有良好的應用前景。

圖6 藍圓鲹分離蛋白消化穩定性Fig. 6 Digestibility of blue round scad protein isolates

3 結 論

本研究通過酸/堿等電點沉淀技術從藍圓鲹肌肉中制備得到了2 種分離蛋白。結果表明，分離蛋白在氨基酸組成上與TP和MP并無顯著差異，這意味著分離蛋白在提高回收率的同時，其營養價值并未改變。此外，API、KPI的凝膠強度均發生明顯下降，但其各自誘因不同。酸分離蛋白是由于發生了較強烈的變性現象，故而失去熱凝膠的形成能力。相比之下，堿分離蛋白的變性程度較低，但與此同時也保留了更高的內源性蛋白酶的活力，這可能與堿分離蛋白回收了大部分的水溶性蛋白有關。體外模擬胃腸液消化實驗表明，API、KPI與TP相比，具有更好的消化性，更易被人體消化吸收，這也說明藍圓鲹分離蛋白可作為一種較理想的蛋白配料應用于食品工業之中。