氣相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定肉中多環(huán)芳烴含量

彭姚珊，李永利，陳 鷹，李 杰*

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上芳香環(huán)的烴類化合物，廣泛存在于環(huán)境、食品及生物體內(nèi)[1]。其中，美國(guó)環(huán)保署優(yōu)先監(jiān)測(cè)的有16 種，被歐盟法規(guī)關(guān)注的有15 種[2-3]。PAHs屬于環(huán)境持久性污染物，具有生物累積性、不易降解等特點(diǎn)，有致畸、致癌、致突變作用[4]。大氣、土壤和水體中的PAHs易被植物吸收，通過(guò)食物鏈的富集并傳遞，最終到達(dá)食物鏈高端的哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)，從而影響其神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等，給健康以致命威脅[4]。因此，研究肉及肉類制品中PAHs的高效檢測(cè)方法具有重要意義，而對(duì)肉中富集的PAHs的檢測(cè)分析同時(shí)在一定程度上反映了環(huán)境中PAHs的水平。

檢測(cè)PAHs常用的儀器方法有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[12-14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-18]、毛細(xì)管電泳法[19]等。其中，GC-MS法相比于其他方法最大程度地排除了基體干擾，選擇性好、靈敏度高，具有較好的定性、定量能力。

對(duì)于食品中痕量有機(jī)殘留分析，由于具有待測(cè)物提取困難、干擾多等特點(diǎn)，采用外標(biāo)法定量分析偏差較大，而選擇與待測(cè)物理化性質(zhì)非常接近的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋質(zhì)譜（isotope diluted mass spectrometry，IDMS）法可以避免因食品復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)、前處理和質(zhì)譜檢測(cè)器等因素對(duì)分析測(cè)定結(jié)果的影響[20-22]，有效地校正了方法中可能出現(xiàn)的誤差，顯著提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。在眾多前處理技術(shù)中，固相萃取技術(shù)具有簡(jiǎn)單、方便、節(jié)省時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于肉類等復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理。而使用分子印跡材料作為固相萃取填料的分子印跡固相萃取（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）技術(shù)由于分子印跡聚合物對(duì)某一類化合物具有特異性選擇，使得其對(duì)目標(biāo)化合物的選擇性、分離效率和富集效率大大提高，有提取和凈化的雙重作用[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲振蕩結(jié)合MISPE技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化，利用IDMS法校正前處理過(guò)程中待測(cè)成分的損失、降低基體效應(yīng)的影響，建立了MISPE-GC-IDMS法同時(shí)對(duì)鮮肉及肉制品中16 種PAHs進(jìn)行檢測(cè)的方法，本方法高效、準(zhǔn)確、靈敏，可以為食品安全監(jiān)測(cè)中PAHs的檢測(cè)工作提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)肉、蝦肉、雞肉、肉松 市售。

萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝16 種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 000 μg/mL） 美國(guó)o2si公司；萘-D8（純度＞99%） 自制；正己烷、二氯甲烷（均為色譜純）美國(guó)Honeywell公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CNW MISPE PAHs固相萃取小柱（500 mg/6 mL） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975B GC-MS聯(lián)用儀（配電子電離源、G2614A自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國(guó)Agilent公司；KQ-50DA超聲振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；PT 2500 E均質(zhì)勻漿機(jī) 德國(guó)Wiggens公司；L530R離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；氮吹儀 丹麥Jun-Air公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取事先已攪碎（最長(zhǎng)邊不大于0.5 cm）的肉制樣品4.000 0 g于研缽內(nèi)，加入質(zhì)量濃度為1 μg/mL的萘-D8同位素內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，再加入8.0 g無(wú)水硫酸鈉，充分研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用10 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）沖洗缽體并轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入15 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V），均質(zhì)勻漿1 min，超聲提取25 min，渦旋振蕩1 min；以4 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至梨形燒瓶；再加入25 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）重復(fù)均質(zhì)勻漿及之后的過(guò)程，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的上清液在30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干至近干，用2 mL正己烷復(fù)溶后待凈化。

1.3.2 凈化

用5 mL二氯甲烷活化固相萃取小柱，重復(fù)3 次后用5 mL正己烷平衡。轉(zhuǎn)移1.3.1節(jié)中正己烷溶液至固相萃取柱頂部，再用3 mL正己烷蕩洗梨形燒瓶并上樣至固相萃取柱。用6 mL正己烷分3 次淋洗后用10 mL二氯甲烷分2 次洗脫，收集流出的二氯甲烷洗脫液。洗脫液用氮?dú)獯蹈珊笥? mL正己烷復(fù)溶，濾膜過(guò)濾后，在儀器分析條件下進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 儀器分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：J&W DB-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至280 ℃；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.5 μL；分流比10∶1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；全掃模式及選擇離子監(jiān)測(cè)模式，16 種PAHs及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1，總離子流圖見(jiàn)圖1。

表1 16 種PAHs及同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間及特征離子Table 1 Retention times and target ions for PAHs and isotope internal standard

圖1 16 種PAHs及同位素內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of 16 PAHs and isotope internal standard

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

圖2 提取溶劑正己烷-二氯甲烷比例對(duì)PAHs回收率的影響Fig. 2 Comparison of PAHs recoveries with different extraction solvent compositions

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]，肉中PAHs的提取多選用正己烷、二氯甲烷。PAHs在正己烷中分配比較高，但同時(shí)會(huì)提取出較多脂肪，干擾測(cè)試；PAHs和脂肪在二氯甲烷中的溶解度具有較大差異，可以降低脂肪引入的基質(zhì)效應(yīng)，但對(duì)PAHs的提取效率較低。為兼顧較高的提取效率和較小的基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用正己烷和二氯甲烷的混合溶劑作為提取試劑，考察混合溶劑的不同比例對(duì)16 種PAHs提取效率的影響（圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）時(shí)，大多數(shù)PAHs具有較好的萃取效率和較高的回收率，故選擇此比例混合溶劑作為提取溶劑。

2.2 樣品凈化條件的選擇

MISPE相比于傳統(tǒng)固相萃取，具有特異識(shí)別性高、目標(biāo)物選擇吸附及富集能力強(qiáng)等特點(diǎn)[25]，在食品、環(huán)境樣品檢測(cè)中顯示出對(duì)PAHs的顯著專一吸附效果[26-27]。對(duì)比不同類型固相萃取填料對(duì)提取液中PAHs富集凈化效果，圖3表明：分子印跡固相萃取柱既可以有效去除提取液中脂肪等雜質(zhì)，又能夠較好地保留16 種PAHs，回收率在85%～110%之間，可達(dá)到分離富集目標(biāo)化合物、降低基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測(cè)靈敏度的目的；硅膠固相萃取柱、中性氧化鋁固相萃取柱、親水親脂固相萃取柱和C18固相萃取柱雖然對(duì)部分含2～3 個(gè)芳香環(huán)的PAHs具有較好的選擇性吸附效果，但對(duì)苯并[b]熒蒽等含4 個(gè)或更多芳香環(huán)的PAHs回收率較低，不適合用于16 種PAHs的凈化。

圖3 固相萃取填料對(duì)PAHs回收率的影響Fig. 3 Comparison of PAHs recoveries with different types of SPE

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限的測(cè)定結(jié)果

將質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL的PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.0、10、20、50、100 ng/mL且內(nèi)標(biāo)萘-D8質(zhì)量濃度均為20 ng/mL的系列溶液，按照儀器分析條件進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：在5～100 ng/mL范圍內(nèi)，各PAHs與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值均與質(zhì)量濃度的比值呈良好線性關(guān)系（線性方程見(jiàn)表2）；除茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝的檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）分別為2.5 ng/mL和5.0 ng/mL外，其余PAHs的檢出限和定量限分別為0.5 ng/mL和1.0 ng/mL，相當(dāng)于樣品中檢出限為0.125～0.625 μg/kg、定量限為0.250～1.250 μg/kg，遠(yuǎn)優(yōu)于GB 5009.265—2016《食品中多環(huán)芳烴的測(cè)定》方法[24]。當(dāng)前我國(guó)對(duì)肉及肉制品僅限定苯并[a]芘的含量不得超過(guò)5.0 μg/kg[28]，雖然國(guó)標(biāo)方法可以滿足限量要求，但歐盟等對(duì)多種食品中PAHs含量要求愈發(fā)嚴(yán)格[29]，我國(guó)政府和人民群眾也對(duì)食品中苯并[a]芘等高毒性物質(zhì)關(guān)注度逐漸增強(qiáng)，仍需要更為靈敏的分析方法測(cè)定肉及肉制品中PAHs含量。

表2 線性方程、檢出限和定量限Table 2 Calibration equations, LODs and LOQs

2.4 精密度及回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度和回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of recoveries and precision (RSDs) tests (n= 6)

按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定空白樣品，并分別進(jìn)行1.25、5.0、20 μg/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每組分別測(cè)定6 次，目標(biāo)物測(cè)定回收率在85.7%～109%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75%～4.90%（表3）。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

市售樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，魚(yú)肉、蝦肉、雞肉、肉松樣品中均檢出萘，含量在17～61 μg/kg之間；魚(yú)肉、蝦肉、肉松樣品中還檢出苊烯和蒽，含量分別為11～81 μg/kg和32～86 μg/kg；此外，還在雞肉中檢出苯并[a]蒽、在魚(yú)肉中檢出?，含量分別為51 μg/kg和12 μg/kg。

表4 樣品分析結(jié)果Table 4 Analytic results of 16 PAHs in different types of meat samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了肉及肉制品中16 種PAHs殘留的GCIDMS檢測(cè)方法，該方法凈化效果好、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確性高，可滿足食品安全檢測(cè)領(lǐng)域多種肉及肉制品中PAHs監(jiān)測(cè)的需求[30]。通過(guò)對(duì)市售魚(yú)肉、蝦肉、雞肉、肉松樣品的檢測(cè)表明，典型肉及肉制品中PAHs的總含量處于較安全水平。