固相萃取-高效液相色譜法測定蘋果汁及其飲料中展青霉素的含量

劉文慧，董 越，王 娜，李紹振*

（北京匯源飲料食品集團有限公司，北京 100000）

展青霉素又名棒曲霉素，是一種非揮發性的內酯類化合物，屬于真菌類毒素，是青霉屬、曲霉屬、羅囊菌屬和絲衣霉屬等多種真菌的次生代謝產物，可溶于水、乙醇、在堿性溶液中不穩定，極易被破壞，具有神經毒性、潛在的免疫毒性、致癌、致畸和致突變性[1-3]。展青霉素主要污染水果及其制品，蘋果及其制品尤為嚴重[4-7]，給蘋果產業帶來了巨大的經濟損失，也對人的健康和安全構成了嚴重的威脅[5-6,8-9]。GB 2761—2016《食品中真菌毒素限量》標準中規定以蘋果、山楂為原料的制品中展青霉素限量為50 μg/kg[10]。GB/T 18963—2012《濃縮蘋果汁》標準中規定展青霉素為出廠檢測項目[11]。

展青霉素的檢測方法有薄層色譜法[12-13]、液相色譜法[14-17]、氣相色譜-質譜聯用法[18]、液相色譜-質譜聯用法[19-21]、免疫學檢測方法[22-23]等。2017年6月23日實施的GB 5009.185—2016《食品中展青霉素的測定》[24]中方法為：第一法同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法，適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。第二法高效液相色譜法，僅適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。第一法從標準品、試劑耗材到檢測用儀器價格都十分昂貴，第二法中使用的展青霉素專用固相萃取凈化柱也價格不菲，檢測成本很高。這給以此作為出廠檢測項目的蘋果濃縮汁生產廠家造成了很大的經濟負擔。因此從企業自控方面考慮，開發適合企業自控用的準確度較高，檢測成本適中的檢測方法尤為重要。

本實驗采用價格相對較低的混合型陰離子交換柱作為凈化柱，采用目前蘋果濃縮汁生產企業都已配備的液相色譜作為檢測儀器，優化前處理條件，評價基質效應，建立了蘋果汁及其飲料中展青霉素檢測的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，此方法準確度較高，成本適中，操作較簡便，為蘋果濃縮汁生產企業提供了適合自控的檢測方法，減輕了蘋果濃縮汁生產企業的經濟負擔。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果汁及其飲料 市售；棒曲霉素標準品（純度99.5%） 美國Sigma公司；乙腈、乙酸、乙酸乙酯（均為色譜純） 百靈威科技有限公司；甲醇（色譜純）美國Fisher公司；乙酸銨（優級純） 鄭州派尼化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

1100系列液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）美國Agilent公司；SE812氮吹儀 北京帥恩科技有限責任公司；ULUP-II超純水機 四川優普超純科技有限公司；BSA224S-CW電子天平 德國賽多利斯公司；UV-2450紫外-可見光分光光計 島津企業管理（中國）有限公司；固相萃取裝置 美國Supelco公司；Cleanert PAX-SPE混合型陰離子交換柱（150 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制及質量濃度標定

標準儲備溶液：用5 mL乙酸乙酯溶解展青霉素標準品5 mg后，移入25 mL的容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻，配制成質量濃度為200 μg/mL的標準儲備溶液，－20 ℃冷凍避光保存。

標準儲備溶液質量濃度標定：參照GB 5009.185—2016[24]。

標準工作溶液制備：取1 000 μL經標定過的展青霉毒素標準儲備溶液，用氮氣吹干后溶解于10 mL pH 4.0水（乙酸調pH值）中，配制成質量濃度為1 000 μg/L的標準工作溶液。根據需要再用pH 4.0水稀釋，配成適當質量濃度的標準工作液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品預處理

蘋果濃縮汁：按照GB/T 18963—2012[11]要求稀釋至原汁，待凈化；蘋果汁及其飲料：取樣品，待凈化。

1.3.2.2 凈化

Cleanert PAX-SPE（混合型陰離子交換柱）活化：依次用5 mL甲醇，5 mL水進行活化，活化后置于超純水中平衡；取2 g待凈化樣品（精確至1 mg）轉移至已預活化好的混合型陰離子交換柱中，控制樣液3 mL/min的穩定速度過柱，上樣完成后，依次加入3 mL乙酸銨溶液（5 mmol/L）、3 mL水淋洗，抽干混合型陰離子交換柱后，加入4 mL甲醇洗脫，棄去初始的1 mL洗脫液，收集后續洗脫液，在洗脫液中加20 μL乙酸，混勻，40 ℃緩慢氮吹至近干后，用乙酸水溶液（20 mL乙酸＋250 mL水）定容至1 mL，混勻，過0.45 μm水相膜，待測。

1.3.3 液相色譜條件

Waters Xbridge C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：A為乙腈，B為超純水；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min；檢測波長254 nm；檢測時間18 min；延遲（后運行）2 min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 展青霉素含量計算

按公式（1）計算展青霉素含量：

式中：x為樣品中展青霉素含量/（μg/kg）；ρ為由校準曲線計算所得的試樣溶液中展青霉素的質量濃度/（μg/L）；V為最終定容體積/mL；m為樣品取樣量/g；f為稀釋倍數。

1.4 數據處理

實驗結果統計分析采用Excel 10.0，圖像處理方法采用Origin 7.5。

2 結果與分析

2.1 檢出限和定量限的測定

2.1.1 展青霉素儀器檢出限[25]

按照1.3.1節配制不同質量濃度的展青霉素標準工作液，按1.3.3節液相色譜條件進樣測定，根據GB/T 27417—2017信噪比法評估檢出限的要求，采用信噪比為3確定展青霉素儀器檢出限為10 μg/L，故此液相色譜檢測方法能夠用于展青霉素的檢測。

2.1.2 蘋果汁中展青霉素方法檢出限和定量限

蘋果汁樣品（空白樣品）和蘋果汁樣品（空白樣品）加標后按1.3.2節處理后按1.3.3節進樣測定，同時測定展青霉素標準工作液，見圖1。

圖1 展青霉素標準品（A）、蘋果汁樣品（B）和蘋果汁樣品（空白樣品）加標（25 μg/kg）（C）液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of patulin standard (A), real apple juice sample(B) and spiked apple juice sample (at 25 μg/kg) (C)

由圖1A可知，展青霉素標準品的保留時間為7.9 min，圖1B在7.9 min未出峰，說明蘋果汁樣品（空白樣品）中未檢出展青霉素，圖1C在7.9 min出峰，說明蘋果汁樣品中若含有展青霉素（含量高于檢出限時）能夠檢出，由此可知此方法可用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

在蘋果汁樣品（空白樣品）中加不同質量濃度水平的展青霉素標準溶液進行測定，根據GB/T 27417—2017信噪比法評估檢出限的要求，采用信噪比為3，確定展青霉素的方法檢出限為8 μg/kg，根據GB/T 27417—2017中定量限為3 倍的檢出限，確定展青霉素的定量限為25 μg/kg，低于GB 2761—2016中對于展青霉素限量50 μg/kg的要求，故此液相色譜檢測方法能夠用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

2.2 展青霉素標準溶液校準曲線

由2.1.2節可知，展青霉素的方法定量限為25 μg/kg，而檢測方法中取約2 g樣品經前處理后定容至1 mL，相當于樣品濃縮約2 倍，故校準曲線以50 μg/L為最低質量濃度。

按1.3.1節配制50、100、200、300、400 μg/L和500 μg/L的系列標準工作溶液，按1.3.3節液相色譜條件進樣重復測定3 次，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制校準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程y=0.097 4x－0.224 2，決定系數R2為0.999 6，表明在50～500 μg/L線性關系良好，校準曲線符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[26]的要求。

2.3 回收率和精密度測試結果

精密度采用變異系數來衡量。在蘋果汁樣品（空白樣品）中加3 個質量濃度水平的展青霉素標準溶液，每個質量濃度水平按1.3.2節處理后按1.3.3節進樣重復測定3 次，按1.3.4節進行結果計算，回收率和精密度結果見表2。

表2 回收率測試結果Table 2 Results of recovery test

由表2可知，回收率和精密度符合GB/T 27404—2008中對于檢測方法回收率和精密度的要求。

2.4 檢測結果準確性測試結果

2.4.1 質控樣品來源及評價方法

從有資質的機構（CNAS認可能力驗證提供者）購買果汁中展青霉素含量檢測內部質控樣品進行測定，質控樣品采用Z-比分數法[27-29]評價測定結果，Z-比分按公式（2）計算：

式中：x為測試結果/（μg/kg）；X為指定值/（μg/kg）； 為標準差/（μg/kg）。X、 由質控樣品提供單位給定。

評價方法：|Z|≤2，滿意結果；2＜|Z|＜3，有問題結果（可疑）；|Z|≥3，不滿意結果（離群）。

2.4.2 質控樣品測定結果

質控樣品按1.3.2節處理后按1.3.3節進樣重復測定6 次，按1.3.4節進行結果計算，展青霉素含量分別為323.536、330.366、328.089、326.851、321.260 μg/kg和321.260 μg/kg，x為325.227 μg/kg， 為3.783 μg/kg，變異系數為1.16%，小于15%[26]。

2.4.3 測定結果評價

按照質控樣給定的評價方法對檢測結果進行評價，由表3可知，質控樣品的檢測結果符合要求。綜上，此展青霉素的檢測方法能夠用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

表3 質控樣品測定結果評價Table 3 Analytical results for the determination of patulin in quality control samples

3 討 論

3.1 展青霉素標準品的選擇和稱量

由于展青霉素標準品價格較高，且標準儲備液配制后需標定確定質量濃度，故展青霉素標準品純度符合要求，不使用有證標準物質也可滿足標準物質溯源的需求。在檢測過程中展青霉素標準品使用量較小，5 mg即可滿足要求，因此建議購買5 mg裝標準品。稱量5 mg的標準品，需要使用至0.001 mg天平[30]，一般工廠化驗室不具備稱量條件，由于標準品在分裝時對于分裝量有允差要求，且配制成標準儲備液后需標定確定溶液質量濃度，故不稱量標準品對標準溶液質量濃度不造成影響，因此可將5 mg裝的展青霉素標準品，不需稱量全部配制成標準儲備液。

3.2 展青霉素標準溶液貯存問題

由于展青霉素容易降解，故展青霉素標準儲備液的貯存條件十分重要，需在－20 ℃冷凍避光條件下貯存。3.1節中提到將購買小包裝展青霉素標準品一次全部配制成標準儲備液，在使用過程中為了避免反復凍融對展青霉素標準儲備液的影響，可將配成的標準儲備液混勻后分裝成幾份，做好標記，－20 ℃冷凍避光貯存。在貯存過程中需對展青霉素標準儲備液濃度定期監測，貯存條件定期監控。展青霉素標準儲備液在－20 ℃避光條件下可貯存3 a。

展青霉素標準工作液實際是由標定液配制而成的，故展青霉素標定液的貯存也尤為重要，同樣需在－20 ℃冷凍避光條件下貯存。在使用過程中注意觀察標定液濃度變化。展青霉素標定液在－20 ℃可貯存6 個月。

展青霉素標準工作液，配制后在4～6 ℃冷藏避光條件下貯存，在使用過程中注意觀察標準工作液濃度變化。展青霉素標準工作液在4～6 ℃冷藏避光下貯存可使用1 個月。

3.3 檢出限

GB/T 27417—2017中檢出限分為儀器檢出限和方法檢出限。儀器檢出限為用儀器可靠地將目標分析物信號從背景（噪音）中識別出來時分析物的最低濃度或量；方法檢出限為用特定方法可靠的將分析物測定信號從特定基質背景中識別或區分出來時分析物的最低濃度或量。

由標準中給定的定義可知，標準品配制成標準工作液后按儀器檢測條件直接進樣得到的是儀器檢出限，而方法檢出限是樣品基體按規定的前處理條件處理后，再按儀器檢測條件檢測得到的檢出限。方法檢出限不但與儀器噪音有關，而且還決定于方法全部流程的各個環節，如取樣、分離富集、測定條件優化等，分析者、環境、樣品性質等對檢出限也均有影響。

因此檢測方法選擇時，儀器檢出限可以確定檢測所用儀器是否能夠用于目標物質的檢測，而檢測方法是否能夠滿足樣品中目標物質檢測定量的需求需要測定方法檢出限。

3.4 基體對于檢測的影響

CNAS-CL01-A002：2018[31]中關于使用的檢測標準中對于樣品基體要求，“實驗室應關注檢測方法中提供的限制說明、濃度范圍和樣品基體”，“任何對標準方法的偏離，都必須進行實驗室確認（如超出適用的濃度范圍或基體使用標準方法）”，由此可見在檢測方法中樣品基體尤為重要，因此不能認為檢測方法能用于一種樣品基體，就能用于所有樣品基體的檢測。經過實驗確認，本研究檢測方法僅適用于蘋果汁及其飲料中展青霉素的檢測，不適用于山楂樣品中展青霉素的檢測。