靈芝中17 種農藥的QuEChERS-氣相色譜-質譜聯用快速檢測技術

崔麗麗，閆梅霞，逄世峰，周春元，王英平*

（中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

靈芝屬于擔子菌綱、多孔菌科、靈芝屬，是一種非常名貴的食藥用大型真菌，具有重要經濟和藥用價值，在我國應用已有2 000多年的歷史。全世界已報道種類200余種[1]，中國藥典中收錄入藥為赤芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.)）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao(Xu et Zhang)）干燥子實體[2]。在我國東北地區靈芝種類分布減少，松杉靈芝（Ganoderma tsugae）是東北地區最常見種類[1]。隨著中醫藥產業健康發展，靈芝需求量增加。目前，栽培靈芝逐漸成為靈芝的主要來源。靈芝的栽培方式有袋料栽培、段木栽培、仿野生林下栽培等[3]。靈芝在制種期和栽培期有多種病菌和雜菌導致病害發生，侵染性病害主要為青霉菌污染率高達80%～90%，靈芝害蟲也多達16 種[4-12]。為降低病蟲害穩定產量提高經濟產值，藥劑防治是必要措施之一。引起食用菌農藥殘留的因素有病蟲害防治過程中化學農藥的使用，也有水土中殘留農藥的污染，或是栽培料中殘留[13-17]。目前主要研究集中于靈芝栽培技術和有效成分研究，在農藥檢測上報道有限。隨著國際貿易增加和對食品安全關注，重金屬和農藥殘留已成為必檢項目，GB 2763—2016《食品中農藥最大殘留限量》中規定我國食用菌農藥殘留指標有21 項，涉及26 種農藥，其中有19 項為最大殘留限量，有2 項為臨時限量[18]。我國是世界食用菌產量大國，我國食藥用菌類產品出口美國、日本、韓國和歐盟等發達國家地區，由于生產方式和標準指標差異等原因，食藥用菌出口貿易原因受到扣留或召回，2011—2016年被召回或扣留595 批次，其中農殘超標引起的有219 批次，占37%[19-20]。而且已有研究發現靈芝等食用菌對農藥具有富集性[21-23]，農藥檢測結果極易存在假陰性。因此，加強農藥殘留檢測方法和農藥合理使用技術研究，這不僅有利于食用菌產品的出口貿易，更關乎我國的食品安全和環境保護。

食用菌農藥提取凈化的前處理方法常見的有均質提取、超聲提取、加速溶劑萃取、固相萃取凈化、凝膠滲透色譜凈化及QuEChERS技術，常用分析技術有氣相色譜法、高效液相色譜法及串聯質譜法[24]。靈芝的農藥殘留限量和檢測方法國內外均沒有明確的規定，已報道相關研究：陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取、凝膠滲透色譜凈化、氣相色譜法測定靈芝中24 種有機磷農藥殘留，王懷豫等[26]用中國藥典方法檢測靈芝中有機氯類農藥，劉志風等[27]采用高速分散提取、弗羅里硅土層析柱石油醚洗脫凈化、氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用法檢測15 種農藥。QuEChERS是農藥殘留檢測的AOAC官方方法和英國國家標準方法EN 15662-2008[28-29]，現已廣泛應用在蔬果[30]、食用菌[31]及中草藥[32]等各類食品藥品中的農藥殘留檢測中。本研究利用QuEChERS方法原理建立集萃取和凈化為一體的新型前處理方法，結合GC-MS檢測系統，用于靈芝中農藥多種殘留快速提取檢測，不僅能夠有效縮短前處理時間，提高檢測效率，而且有機溶劑用量顯著降低，使得農殘分析更環保，保障了檢測人員身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品靈芝子實體由延邊大陽參業有限公司提供，經過自然干燥后取不少于200 g試樣，置于高速粉碎機中粉碎、混勻，裝入聚乙烯塑料袋中保存。

乙腈、丙酮、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；水為GB/T 6682規定的一級水；0.22 μm有機相微孔濾膜、凈化試劑盒64501、64504、64512（N-丙基乙二胺（primary secondaryamine，PSA））、MgSO4、C18填料） 北京迪馬科技有限公司。

農藥標準物質：α-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.319-84-6），β-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.319-85-7），γ-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.58-89-9），δ-六六六（C6H6Cl6，純度98.1%，CAS No.319-84-6），六氯苯（C6Cl6，純度99.5%，CAS No.118-74-1），p,p’-DDD（C14H10Cl4，純度98.1%，CAS No.72-54-8），o,p’-DDT（C14H9Cl54，純度99.5%，CAS No.789-02-6），p,p’-DDT（C14H9Cl5，純度98.9%，CAS No.50-29-3），p,p’-DDE（C14H8Cl4，純度99.5%，CAS No.72-55-9），嘧菌環胺（C14H15N3，純度100%，CAS No.121552-61-2），腐霉利（C13H11Cl2NO2，純度100%，CAS No.32809-16-8），五氯硝基苯（C6Cl5NO2，純度99.5%，CAS No.82-68-8），二嗪磷（C12H21N2O3PS，純度100%，CAS No.333-41-5），醚菌酯（C18H19NO4，純度99%，CAS No.143390-89-0），異菌脲（C13H13Cl2N3O3，純度98.6%，CAS No.36734-19-7），丙環唑（C18H19NO4，純度99.5%，CAS No.60207-90-1），嘧菌酯（C22H17N3O5，純度99.5%，CAS No.131860-33-8），乙霉威（C14H21NO4，純度99.5%，CAS No.87130-20-9），苯醚甲環唑（C19H17Cl2N3O3，純度99.5%，CAS No.119446-68-3），甲霜靈（C15H2NO4，純度99.5%，CAS No.57837-19-11）。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型GC-MS聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；天平（感量為0.001 g和0.000 1 g） 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；TGL-16M高速離心機 湖南湘儀離心機有限公司；T25均質器德國IKA公司；Vortex-Genie渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-5石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）或相當者；程序升溫：初始柱溫120 ℃保持1 min，10 ℃/min升到260 ℃，保持10 min；載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min，尾吹氣流量20 mL/min，不分流進樣，進樣體積為1 μL。

1.3.2 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，離子源溫度200 ℃；單離子掃描模式（single ion monitoring，SIM）；溶劑延遲時間10 min。

1.3.3 標準溶液配制

精密稱取50 mg各標準物質丙酮溶解配制成質量濃度500 μg/mL儲備液，貯存于－20 ℃。

精密吸取適量的儲備液于25 mL容量瓶中正己烷定容，配成1 μg/mL混合標準工作液。

1.3.4 樣品液制備

稱取粉碎均勻試樣1.0 g（精確到1 mg），加入10 mL純水浸泡30 min，加入20 mL乙腈，高速勻漿均質提取2 min（10 000 r/min），加入6 g NaCl高速渦旋振蕩混勻1 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液4 mL，加入含有150 mg PSA、900 mg MgSO4凈化包（No.64504），高速渦旋1 min混勻，以5 000 r/min離心5 min，取上清液上機檢測。

1.4 數據分析

通過色譜分析儀器GC-MS獲得數據使用Excel 2006進行數據分析和圖像處理。

2 結果與分析

2.1 色譜質譜條件確定

選擇對弱極性化合物分離較好的毛細管柱色譜柱HP-5，通過Scan模式掃描，確定農藥的保留時間，選擇定性定量離子，建立SIM離子監測方法，每種農藥選擇一個定量離子，2 個定性離子，按照保留時間順序分段檢測。每種農藥的保留時間及定量、定性離子見表1。

表1 農藥的質量分析參數Table 1 Mass spectrometric parameters for pesticides

續表1

2.2 樣品前處理條件優化2.2.1 提取條件確定

表2 靈芝樣品不同前處理的回收率Table 2 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different pretreatments

QuEChERS法中常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，乙腈因其最適宜于萃取極性范圍較寬的多種農藥，且萃出物中雜質含量較低[33]，因此是目前使用最廣泛的提取溶劑。根據農藥的溶解性和穩定性，同時參照EN15662[28]和AOAC[29]的QuEChERS方法，也選擇乙腈作為提取溶劑。本實驗提取方法主要考察振蕩提取和高速均質提取，結果發現大部分農藥均質提取效果好于振蕩提取。前處理包括提取和凈化兩個步驟，實驗中加入萃取鹽包（4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g TSCD和0.5 g DHS）和凈化包64507，但是添加回收率很低，分析可能原因：一是加入萃取鹽產生大量熱量造成熱不穩定農藥的分解，二是凈化包64507中含有C18，C18主要用于去除非極性雜質效果良好[34]，然而有機氯農藥正是屬于非極性較強的化合物，因此C18吸附對回收率產生很大影響。均質提取時改加氯化鈉促進分層，凈化使用不含C18的64501，半數農藥回收率提高至70%～120%范圍內（表2），由此可見在靈芝中農藥檢測前處理時盡量減少對農藥的分解和吸附，靈芝本身對農藥和重金屬的富集特性[15-16]，極易導致農藥提取不充分而影響檢測結果準確性。

2.2.2 凈化條件篩選

2.2.2.1 凈化劑篩選

QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、無水MgSO4等[35]。農殘檢測時凈化效果極大地影響檢測儀器和檢測結果，考察64501、64504、64512和64565四種凈化試劑盒的凈化效果（圖1）。隨著PSA和MgSO4量提高，如有機氯類α-六六六、β/γ-六六六、δ-六六六、p,p’-DDT、腐霉利、五氯硝基苯等多數農藥的回收率明顯提高，而含有Carb和C18會吸附部分農藥導致收率有所降低。本實驗選擇凈化試劑盒64504作凈化劑，回收率相對較高，在農殘檢測規定的70%～120%之間農藥17 種，異菌脲、乙霉威和苯醚甲環唑的回收率高于120%，分析原因可能是靈芝的基質增強效應所致，可以采用靈芝基質液配制農藥標準液。

圖1 不同凈化試劑盒處理后靈芝中農藥回收率Fig. 1 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different purification kits

2.2.2.2 提取液凈化體積篩選

固定量的凈化劑對不同體積提取液的凈化效果不同，因此要確定提取液的最佳上樣凈化體積，比較2、4、8 mL提取液上樣凈化效果。按照設想體積越小凈化效果越好，農藥回收率也高，然而實驗結果（圖2）表明隨著凈化的提取液體積增加大部分農藥回收率增加，但是凈化后溶液顏色隨上樣體積增加而加深，說明凈化劑的含量雖然能保證凈化效果，對儀器的污染也在增加。因此本實驗選擇吸取4 mL提取液凈化，既能夠保證凈化效果，又最大程度地降低對儀器污染。

圖2 不同凈化液體積對靈芝中農藥回收率影響Fig. 2 Recoveries of pesticides from Ganoderma tsugae with different volumes of extract sample

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

表3 17 種農藥線性回歸方程和相關系數Table 3 Calibration equations, linearity ranges and correlation coefficients for 17 pesticides

分別精密吸取各農藥標準物質儲備液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L系列的標準工作液，按選定的實驗方法進行測試，經選擇離子定量掃描，以峰面積（y）為縱坐標、以質量濃度（x）為橫坐標作標準曲線，得各農藥的線性回歸方程和相關系數。以定量離子信噪比RSN為3為樣品檢出限，RSN為10為定量限。表3表明，17 種殺菌劑線性關系良好，相關系數大于0.98，方法檢出限在0.002～0.022 mg/kg之間，定量限在0.007～0.072 mg/kg之間。

2.3.2 儀器精密度實驗結果

添加農藥混合標準溶液使之添加量為0.5 mg/kg的靈芝樣品，經過前處理后，GC-MS上樣，每個樣品連續測試5 針，提取定量離子獲得每種農藥的峰面積，計算標準偏差，實驗設置2 個平行。結果表明儀器精密度良好，90%農藥相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1.06%～7.53%之間，嘧菌酯、丙環唑稍高，在10.26%～19.70%之間（圖3）。

圖3 GC-MS儀器精密度實驗結果Fig. 3 Results of instrumental precision of GC-MS

2.3.3 方法的準確性

表4 松杉靈芝中農藥的添加回收率和RSD（n= 3）Table 4 Recoveries and RSDs of pesticides from spiked G. tsugae (n= 3)

樣品中準確加入一定量混合標準溶液，使添加量分別為0.05、0.1、0.5 mg/kg，按最優條件進行測定，每個添加實驗設定3 個平行和1 個對照，計算加標平均回收率和3 次測定的RSD。結果（表4）表明方法準確可行，17 種農藥回收率范圍在71.10%～119.55%，RSD范圍為0.47%～20.05%。陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取靈芝中二嗪磷平均回收率86%，而本實驗建立的QuEChERS-GCMS方法二嗪磷平均回收率為94.04%。

3 結論與討論

QuEChERS法是基于基質固相分散而開發的，主要包括以下步驟：1）待測樣品的粉碎和均質處理。2）待測組分的提取：使用有機溶劑和水的混合溶劑溶解樣品中的待測組分，并通過液液分配使待測組分集中于上層有機溶劑中。3）待測樣品的凈化：通過添加凈化劑去除待測樣品中的脂肪酸、色素、糖類等雜質。靈芝子實體因木質化程度高，使用中藥粉碎機粉碎后成絮狀，有研究表明普通粉碎靈芝多糖等有效成分提取效率低[36]。本實驗通過勻漿機刀頭上萬轉的高速旋轉進行均質，充分粉碎木質化的靈芝子實體的組織和細胞使待測組分在樣品中的分布更均勻，同時提取時加入鹽析劑NaCl，調節極性、減少極性雜質的干擾，利于乙腈對農藥的充分提取，并促進液液分配。

常規農殘檢測方法索氏提取、磺化法凈化中國藥典規定方法超聲波提取、溶劑萃取凈化相比，索氏提取的提取效率高于藥典超聲法[37]，但索氏提取熱回流耗時較長一般需要數小時[38]。本研究采用改進的QuChERS方法提取和凈化樣品，利用GC-MS的SIM模式快速檢測靈芝中農藥多殘留，操作簡單、檢出限低。該方法的平均回收率為71.10%～119.55%，RSD基本小于20%，完全符合農藥殘留分析的要求，且在40 min內即可完成17 種農藥多殘留分析，整個檢測只需20 mL乙腈，具有快速、準確、環保的優點，極大地提高了檢測效率，也減少了對環境的污染，保障了檢驗人員的健康。但最初的實驗設計是預建立六六六、DDT、五氯硝基苯、甲霜靈、嘧菌酯、嘧菌環胺等20 種農藥多殘留同時檢測方法，但在實驗中異菌脲、苯醚甲環唑和乙霉威3 種農藥的添加回收率高于120%，分析原因可能與靈芝基質效應有關。課題組擬開展靈芝基質效應在農藥殘留檢測中影響研究。