丙二醛氧化對米糠蛋白結構及功能性質的影響

周麟依，孫玉鳳，吳 非*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國米糠資源豐富，年產量達1 800萬 t。米糠中蛋白質約占20%。米糠蛋白中可溶性組分約占七成，近似于大豆蛋白。米糠蛋白所含有的必需氨基酸組成相對完整，接近于聯合國糧農組織/世界衛生組織推薦模式。米糠蛋白中的賴氨酸含量比大米胚乳、小麥面粉等谷物蛋白的含量相對要高，并且米糠蛋白的生物效價接近于乳酪蛋白，消化率高于90%，因此被認為是一種高營養價值的植物蛋白。

蛋白質的氧化是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接誘導或者由氧化應激反應的次級副產物間接誘導反應。氧化過程產生的這種結構修飾使蛋白質結構發生顯著變化，如主鏈斷裂、分子交聯、分子解折疊以及構象改變。目前，可誘導蛋白質氧化的促氧化劑種類較多，如分子氧受到光活化轉化為激發單線態氧（1O2），或減少一個電子形成超氧陰離子自由基（O2－·）。而脂肪氧化也可促使蛋白質氧化，脂肪氧合酶會催化大豆油、米糠油等植物油氧化，在此過程中會產生大量的烷氧自由基以及醛、酮等活性次生氧化產物，這些氧化產物氧化活性較高，進一步誘導了蛋白質氧化。米糠含有活性較強的脂肪水解酶及脂肪氧化酶，它們可水解脂質產生游離脂肪酸，從而導致米糠酸敗[1]。此過程中產生的游離脂肪酸容易氧化形成脂質自由基和脂質活性產物，進而誘導米糠蛋白氧化，嚴重影響了米糠蛋白的功能性[2-4]。

目前，脂質過氧化被定義為多不飽和脂肪酸或脂質的氧化變質。脂質過氧化是由一個自由基的復雜鏈反應所引起。多不飽和脂肪酸受自由基的氧化還原奪氫反應生成脂質烷基自由基，而后通過分子重排作用形成共軛二烯結構，繼而共軛二烯結構在脂質烷基自由基上進一步通過氧化反應逐步形成結構穩定性相對較差的脂質氫過氧化物[5]。脂質氫過氧化物失穩后逐漸轉化為活性羰基化合物[6]。對比于脂質自由基及脂質氫過氧化物，活性醛分子具有更穩定的結構，并可通過更大的分子擴散作用對蛋白產生更大程度的氧化攻擊[7]。最具代表性且最易造成氧化損傷的脂質過活性產物主要是丙烯醛、4-羥基-2-壬烯醛及丙二醛（malondialdehyde，MDA），并且MDA是脂質過氧化反應最易形成的活性醛，盡管MDA的氧化反應活性弱于丙烯醛，但由于分子內存在兩個羰基，可通過與蛋白質之間發生更大程度共價交聯影響蛋白質結構及功能性[8-9]。當蛋白質和過氧化脂質接觸反應時，過氧化脂質亦可通過疏水相互作用或氫鍵作用與蛋白復合生成脂蛋白復合體[10-12]。在脂質氧化反應生成的多種活性醛均可與氨基發生醛醇縮合作用進而形成色素物質[13-15]，甚至嚴重影響酶活性及蛋白質生物效價及營養健康功能[16-18]。

目前，MDA對部分植物蛋白結構及功能的影響已有研究，但MDA氧化對米糠蛋白結構及功能的研究較少。因此，選MDA代表脂質過氧化反應中的活性次生氧化產物，研究脂質過氧化產物對米糠蛋白結構和功能性質以及構效關系的影響。本研究有助于全面深入了解米糠蛋白的氧化機理，為米糠蛋白產品的合理研發提供思路，促進米糠蛋白產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白由實驗室自制；1,1,3,3-四甲氧基丙烷（1,1,3,3-tetramethoxy propane，TMP）、鹽酸胍 美國Sigma公司；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；二硝基苯肼 天津博迪化工股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統 美國尼高力公司；PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白提取

取原料米糠過60 目篩，按照1∶10（g/mL）加入正己烷，室溫下不斷攪拌脫脂4 h，反復脫脂2～3 次，在4 000 r/min離心10 min，上清液用蒸餾法回收正己烷，脫脂后將米糠置于通風櫥揮發48 h，再將脫脂米糠過60 目篩，取10 g放入100 mL蒸餾水中，用0.1 mol/L NaOH溶液調節溶液pH 9.5，在50 ℃條件下攪拌2 h，然后在3 000 r/min離心20 min，將沉淀去除，再用0.1 mol/L HCl溶液調節溶液pH 3.8后3 000 r/min離心20 min，將去除上清液，沉淀即為米糠蛋白，將米糠蛋白用蒸餾水洗脫兩次并最終調節pH 7.0，并進行凍干備用。

1.3.2 MDA氧化米糠蛋白的制備

參考Adams等[9]方法通過水解TMP制備MDA。將10.0 mL 5.0 mol/L鹽酸加入31.6 mL蒸餾水中充分混勻后加入8.4 mL TMP，快速移入避光水浴鍋中在40 ℃條件下進行30 min氧化反應，通過隔時攪拌處理防止團聚物產生，TMP水解處理后迅速用6 mol/L氫氧化鈉調節反應溶液pH 7.6，繼而利用0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液定容TMP水解液至1 L。通過摩爾吸光系數31 500 L/（mol·cm）精確定量MDA的濃度，為了保證MDA的氧化活性，反應儲液需要現配現用。

為制備MDA氧化誘導米糠蛋白，利用0.01 mol/L、pH 7.6的磷酸鹽緩沖溶液調配米糠蛋白溶液至質量濃度為10 mg/mL，并加入0.5 mg/mL NaN3防止蛋白腐敗變性，別用0.001、0.01、0.1、1 mol/L的MDA溶液作為氧化誘導劑加入的米糠蛋白溶液中，經過隔日避光25 ℃恒溫條件下連續振蕩進行氧化處理，誘導米糠蛋白發生MDA氧化。氧化誘導后米糠蛋白溶液迅速進行4 ℃冷浴處理，之后轉移至低溫離心機中30 min二次離心處理，留存上清液通過低溫透析處理后濾去未參與反應的MDA，剩余蛋白組分經過24 h冷凍干燥后即可制備為MDA誘導氧化米糠蛋白。

1.3.3 米糠蛋白羰基含量測定

蛋白質氧化程度主要利用Huang Youru等[19]羰基含量的測試分析方法進行測試。1.3.2節制備的氧化米糠蛋白充分溶解于去離子水中，經過2 h充分攪拌后進行4 ℃低溫10 000×g離心30 min，通過Lowery法確定上清液中氧化蛋白質量濃度，通過稀釋調控上清液中氧化蛋白質量濃度為3～6 mg/mL。

將上述0.35 mL的氧化蛋白溶液加入1 mL 2 mol/L HCl溶液中（含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼），在室溫條件下水浴處理2 h。另取0.35 mL氧化米糠蛋白溶液加入1 mL不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液中，在相同處理條件進行實驗作為空白對照組。實驗組及對照組離心管中分別加入0.45 mL 40%的三氯乙酸溶液快速充分混合后低溫10 000×g離心20 min，除去上清液，保留沉淀組分利用乙醇與乙酸乙酯的等體積溶液進行多次洗滌離心，保留最終沉淀蛋白。將收集蛋白溶解入1.0 mL 0.1 mol/L含6 mol/L鹽酸胍的pH 7.0磷酸鹽緩沖液，通過37 ℃水浴處理20 min，通過隔時快速搖晃防止聚沉現象的發生。以空白組為參比在367 nm波長處進行數值矯正，最終以22 000 L/（mol·cm）的消光系數計算蛋白質羰基含量。

1.3.4 米糠蛋白游離氨基的測定

400 mg鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中，而后依次向溶液中加入預先配制的質量濃度為200 g/L十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液2.5 mL及濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL，繼而轉移至通風櫥內加入100 μL的β-巰基乙醇，最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL，制備成OPA溶液用于后續檢測分析，量取OPA試劑4 mL與200 μL氧化米糠蛋白樣品充分混勻后進行35 ℃水浴處理2 min，以蒸餾水空白組為對照在340 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 米糠蛋白游離巰基和二硫鍵含量測定

利用經典的5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB）比色法對蛋白游離巰基、總巰基及二硫鍵含量進行分析測定。取150 mg氧化米糠蛋白加入10 mL 0.1 mol/L含有l mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% SDS的pH 8.0的磷酸鹽緩沖液A中，充分混合均勻后8 000 r/min離心30 min，利用Lowery法對上清液中氧化米糠蛋白含量進行定量。為精確測定游離巰基含量，量取3 mL上述氧化米糠蛋白溶液加入磷酸鹽緩沖液A后，滴入0.1 mL DNTB溶液（39.6 mg DNTB溶解于10 mL磷酸鹽緩沖液A中制備得到），充分振蕩混合后進行室溫1 h水浴處理，水浴處理后溶液經30 min的低溫高速離心處理取上清液，通過參比DNTB空白組，在412 nm波長處測定吸光度，以13 600 L/（mol·cm）消光系數計算游離巰基含量。精確測定氧化米糠蛋白中總巰基基團含量，取1 mL氧化米糠蛋白溶液，依次加入0.05 mL β-巰基乙醇及4 mL 0.1 mol/L尿素-鹽酸胍混合溶液（5∶8，V/V），充分混合后進行室溫1 h水浴處理后，將10 mL 12 g/100 mL三氯乙酸加入溶液中進行室溫水浴處理1 h，再次以4 500 r/min離心10 min獲取沉淀物，重復上述步驟兩次后，將最終沉淀物溶液于最后將沉淀溶解在10 mL 0.1 mol/L其中含有l mmol/L EDTA和1% SDS pH 8.0磷酸鹽緩沖液中，再加入0.08 mL DNTB試劑，劇烈振蕩搖勻溶液后在室溫條件下進行水浴處理1 h，再加入10 mL 12 g/100 mL的三氯乙酸，室溫條件下二次水浴處理1 h，將混合溶液中速低溫離心處理10 min。蛋白沉淀物再次分散于20 mL 12%的三氯乙酸溶液中，充分離心棄去β-巰基乙醇組分，重復3 次上述處理后低溫高速離心30 min。以不加DNTB的空白對比組進行參比，測定上清液412 nm波長處的吸光度，以13 600 L/（mol·cm）消光系數計算氧化米糠蛋白中總巰基含量。

1.3.6 米糠蛋白傅里葉紅外光譜分析

為有效消除蛋白質熒光背景，利用BRAVO拉曼光譜儀對大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液進行拉曼分析測試，測試條件為功率80 mW、激發光波長532 nm、曝光時間60 s，掃描300～3 500 cm－1范圍內的波數譜段，每個樣品都重復掃描3 次以上，由計算機做信號累加平均并繪圖輸出，峰位誤差控制在±3 cm－1內。

1.3.7 米糠蛋白內源熒光光譜分析

將氧化米糠蛋白分散溶解于中性磷酸鹽緩沖溶液中，調控氧化米糠蛋白質量濃度為0.15 mg/mL。熒光分光光度計以米糠蛋白所含的色氨酸基團為熒光探針，為避免酪氨酸的熒光干擾，設置熒光光譜的激發波長為290 nm，熒光發散光譜的掃描范圍設置為300～400 nm，激發狹縫和發射狹縫寬設置為7.5 nm[20]。

1.3.8 米糠蛋白表面疏水性測定

參考Kato等[21]的8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定氧化米糠蛋白表面疏水性并進行適當修正。用0.1 mol/L中性磷酸鹽緩沖溶液充分溶解米糠蛋白，10 000×g高速離心處理30 min除去沉淀物，以Lowery法分析測試上清液中蛋白質量濃度，通過磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋，調控氧化米糠蛋白溶液質量濃度為0.05～0.4 mg/mL，取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同質量濃度的米糠蛋白溶液4 mL，經振蕩混勻后靜置3 min，然后進行熒光強度測試，測試條件為激發波長λex為390 nm，發射波長λem為468 nm，掃描夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。將熒光強度與蛋白質量濃度作線性圖，以初始段的斜率值計為氧化米糠蛋白的表面疏水性大小。

1.3.9 米糠蛋白凝膠電泳分析

參考Laemmli[22]凝膠電泳測試方法對氧化米糠蛋白并作適度調整。分離膠和濃縮膠分別為12%、 5%。將氧化米糠蛋白樣品與上樣緩沖溶液混合配制蛋白質量濃度為1 mg/mL，上樣緩沖溶液的配制通過加入100 mg SDS、0.25 mL β-巰基乙醇、2 mg溴酚藍、2 mL pH 8.0的0.05 mol/L Tris-HCl溶液、2.0 mL甘油，最后定容至10 mL。在95 ℃水浴條件下加熱5 min。蛋白凝膠電泳的上樣量為10 μg。電泳測試過程中調控濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。以甲醇、冰乙酸、0.1%考馬斯亮藍R-250配制染色劑侵染蛋白電泳膠，并以甲醇、冰乙酸、水配制為脫色劑用于脫除蛋白電泳膠的底色背景。

1.3.10 米糠蛋白溶解度測定

參考Shimada等[23]的方法。準確稱取20 mg氧化米糠蛋白樣品充分溶解于10 mL蒸餾水中，在室溫條件下充分攪拌1 h，高速離心20 min除去沉淀。以Lowry法測定上清液中蛋白質質量濃度，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。以上清液質量濃度與米糠蛋白質量濃度的比例表示米糠蛋白溶解度。

1.3.11 米糠蛋白粒徑分布測定

利用Mastersizer 2000激光光散射儀對米糠蛋白的粒徑分布進行分析測定。不同氧化誘導條件處理下的米糠蛋白樣品溶解于去離子水中并配制溶液質量濃度為1 mg/mL，在室溫條件下充分攪拌3 h，隔夜處理后保證氧化米糠蛋白充分溶解，用激光光散射儀進行米糠蛋白的粒徑分布測試，折射率為1.330[24]。

1.3.12 米糠蛋白濁度測定

將氧化米糠蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋40 倍，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，用紫外分光光度計測定600 nm波長處的吸光度，濁度計算公式為：

式中：A為稀釋乳液在600 nm波長處的吸光度；V為稀釋倍數；I為光程差0.01 m。

1.3.13 米糠蛋白乳化性和乳化穩定性測定

取1.0 mL植物油和3.0 mL 0.2%米糠蛋白磷酸鹽緩沖溶液，混合振蕩并進行高速均質處理制備為均一乳液，從底部抽取50 μL樣品，用5 mL 0.1% SDS溶液稀釋，在500 nm波長處測吸光度A0。靜置30 min后再此從底部各取50 μL樣品，用5 mL 0.1% SDS溶液稀釋，測吸光度A30，同溶度SDS為空白。按式（2）、（3）計算米糠蛋白乳化性和乳化穩定性：

式中：T為濁度（2.303）；N為稀釋倍數250；C為乳化液形成前蛋白質溶液中蛋白質量濃度/（g/mL）；U為乳化液中油的體積分數（0.25）；A0為0 min的吸光度。

1.3.14 米糠蛋白起泡性和泡沫穩定性測定

準確稱量0.2 g米糠蛋白樣品置于已加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液20 mL的50 mL燒杯中。使用高速分均質機以10 000 r/min均質30 s，連續3 次約30 min，測均質后體積（V0），靜置30 min后再此讀取液面體積V30。起泡性和泡沫穩定性參見公式（4）、（5）：

1.4 數據處理與統計分析

每個實驗均進行3 次重復平行實驗，利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，用Tukey's HSD法進行ANOVA差異性檢驗，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 9.1軟件、OMNIC軟件包、PeakFit 4.12軟件分析等進行數據分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 氧化對米糠蛋白羰基含量的影響

圖1 MDA氧化誘導對米糠蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of MDA concentration on carbonyl content of rice bran protein

氨基酸側鏈上的NH－或NH2－基團極易受到羥自由基的攻擊，進而氧化生成新的羰基基團[25-26]。如圖1所示，氧化米糠蛋白羰基含量隨著MDA濃度增大逐漸增加。這是由于MDA可與蛋白質分子中的伯胺以等比例的加成反應形成烯胺加合物，從而為蛋白分子引入了新的羰基基團。此外，研究發現MDA可作用于半胱氨酸、組氨酸及賴氨酸等氨基酸殘基的親核側鏈基團進而反應生成席夫堿誘導蛋白羰基化[27-28]。另外，由于MDA結構的特殊性，在MDA分子上連接有兩個羰基，因此MDA分子中的一個羰基氧化作用連接于蛋白質的可同時引入另外一個羰基基團[9]。Burcham等[29]研究發現MDA氧化誘導牛血清白蛋白的羰基值隨著MDA氧化誘導濃度的增大及氧化誘導時間的延長而逐漸增加。

2.2 MDA氧化對米糠蛋白二級結構的影響

圖2 MDA氧化米糠蛋白的紅外光譜Fig. 2 FTIR spectra of MDA oxidation of rice bran protein

表1 MDA氧化對米糠蛋白二級結構的影響Table 1 Effect of oxidative modification by malondialdehyde on secondary structure contents of rice bran protein%

如圖2和表1所示，隨著MDA氧化誘導濃度的增加，米糠蛋白α-螺旋結構、β-折疊結構以及反平行式β-折疊結構含量逐漸增加，無規卷曲和β-轉角結構含量逐漸下降。α-螺旋結構、β-折疊結構及反平行式β-折疊結構逐漸增加，這主要是與氧化米糠蛋白分子間疏水作用和靜電作用增大誘導了蛋白分子聚集有關，此外MDA誘導氧化米糠蛋白的共價交聯聚集也是可能原因。Sun Weizheng等[30]研究發現肌原纖維蛋白β-折疊含量隨加工時間的延長氧化程度的增大而增加，并且氧化聚集與反平行式β-折疊結構逐漸增加有關。無規卷曲和β-轉角結構逐漸降低可能是因為部分無規卷曲和β-轉角結構轉變為β-折疊結構。

2.3 MDA氧化對米糠蛋白內源熒光光譜的影響

圖3 MDA氧化誘導的米糠蛋白內源熒光譜圖Fig. 3 Intrinsic fluorescence of rice bran protein oxidized by MDA

如圖3所示，隨著MDA濃度的增加，氧化米糠蛋白內源熒光λmax呈現逐漸藍移的趨勢。研究發現，MDA氧化會使兔肌球蛋白、α-晶狀體球蛋白以及牛血清白蛋白的內源熒光λmax藍移的現象[31-33]，并且Traverso等[33]認為MDA誘導氧化蛋白質內源熒光強度下降主要是由于MDA誘導氧化聚集包埋了色氨酸的原因。在酸性條件MDA易與蛋白色氨酸上的吲哚基團發生反應進而猝滅色氨酸熒光[34]，而由于在本研究中所采用反應條件近中性，故而排除了MDA與色氨酸吲哚基團反應引起的熒光猝滅的可能性，造成米糠蛋白內源熒光強度下降應當主要與氧化米糠蛋白的共價交聯聚集有關。Sun Wenzheng等[35]研究表明熒光強度的變化可用來表征蛋白質氧化情況以及結構變化，乳液熒光強度顯著降低表明蛋白質的結構逐漸展開。葉林[5]研究發現隨著氧化濃度的增加，花生蛋白的熒光強度逐漸下降，表明蛋白質色氨酸殘基被轉移到更加疏水的非極性環境中。

2.4 MDA氧化對米糠蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

表2 米糠蛋白樣品游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量Table 2 Free sulfhydryl, total sulfhydryl and disulfide bond contents of rice bran protein samples oxidized by MDA

由于巰基對氧化的極高敏感性，蛋白氧化最早期現象主要為巰基的氧化[36]。如表2所示，隨著MDA濃度的增加，二硫鍵、游離巰基和總巰基含量逐漸降低，這可能是由于自由基活性較高，氧化米糠蛋白二硫鍵逐漸斷裂，內部的巰基雖然隨著蛋白質結構解折疊而暴露，但自由基迅速與其結合形成亞磺酸和磺酸等氧化產物，使二硫鍵含量，游離巰基和總巰基含量不斷降低。

2.5 MDA氧化對米糠蛋白游離氨基含量的影響

圖4 MDA氧化對米糠蛋白游離氨基含量的影響Fig. 4 Effect of MDA oxidation on free amine content of rice bran protein

蛋白側鏈上帶有的氨基酸均易受到自由基和非自由基ROS攻擊。如圖4所示，MDA氧化誘導使米糠蛋白游離氨基含量隨著氧化濃度的增加逐漸減少，MDA分子中的羰基可直接與米糠蛋白上的氨基發生共價交聯反應，進而降低了米糠蛋白的游離氨基含量。

2.6 MDA氧化對米糠蛋白溶解度的影響

圖5 MDA氧化對米糠蛋白溶解度的影響Fig. 5 Effect of MDA oxidation on solubility of rice bran protein

如圖5所示，隨著MDA氧化誘導濃度的增加，氧化米糠蛋白溶解度呈現逐漸下降的趨勢。這主要是由于氧化米糠蛋白發生了共價交聯聚集，不可溶性的交聯聚集體形成降低了米糠蛋白的溶解性。劉晶等[37]研究表明低濃度MDA氧化誘導下大豆蛋白趨于可溶性聚集，而在高濃度MDA氧化誘導下大豆蛋白共價交聯聚集體逐漸形成，同時誘導了可溶性聚集體的再聚集，進而形成了不可溶性蛋白聚集物，為大豆蛋白溶解性隨氧化誘導濃度增大逐漸降低的原因。

2.7 MDA氧化對米糠蛋白電泳結果的影響

圖6 MDA氧化誘導米糠離蛋白的電泳圖Fig. 6 Electrophoresis profiles of rice bran protein with MDA

米糠蛋白是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成的。盡管現有研究已利用對不同電泳條帶進行了提取和分析，但米糠蛋白中4 種主要蛋白的亞基歸屬尚無統一定論。Adebiyi等[38]研究指出米糠白蛋白主要亞基的分子質量約為31～45 kDa，米糠球蛋白主要亞基的分子質量約為33 kDa和53 kDa。Hamada[39]研究表明的米糠白蛋白和球蛋白的分子質量分別為10～100 kDa和10～150 kDa。Wang Changyuan等[40]研究發現米糠白蛋白的主要亞基分布于14～32 kDa分子質量區間，而米糠球蛋白主要亞基的分子質量為63、53、49、36、22 kDa，米糠谷蛋白的主要亞基的分子質量為54、37、21、13 kDa，而醇溶蛋白的主要亞基分子質量為13 kDa和22 kDa。

如圖6所示，對比已有研究可以認定米糠蛋白的主要亞基的分子質量分別為62、53、49、36、25、21、18、14 kDa，米糠白蛋白主要亞基的分子質量為36 kDa和14 kDa，分子質量為62、53、49、36、21 kDa的電泳條帶歸屬于米糠球蛋白亞基，米糠谷蛋白主要亞基的分子質量為53、36、21 kDa和14 kDa，醇溶蛋白主要亞基的分子質量分別為21 kDa和14 kDa。低氧化誘導濃度下MDA對米糠蛋白亞基組成無顯著影響，隨著MDA氧化誘導濃度增加，分子質量為53、49、36、21、14 kDa的亞基歸屬條帶均有所變淺，條帶逐漸變窄。MDA分子中含有兩個羰基，當兩個羰基與不同多肽鏈間的氨基同時形成席夫堿時就會導致蛋白質共價交聯。由此可知，分子質量為53、49、36、21 kDa和14 kDa的亞單位產生了不可溶性交聯聚集。而隨著氧化誘導濃度的增加，分子質量為36、21、14 kDa的亞基逐漸消失，表明蛋白交聯聚集主要發生于上述亞基，亞基條帶的消失也是米糠蛋白功能性降低的重要原因。

2.8 MDA氧化對米糠蛋白表面疏水性的影響

圖7 MDA氧化對米糠蛋白表面疏水性的影響Fig. 7 Effect of oxidation by MDA on surface hydrophobicity of rice bran protein

如圖7所示，隨著MDA氧化誘導濃度的增加，米糠蛋白表面疏水性逐漸下降。這可能是由于氧化米糠蛋白分子結構展開，暴露出來的巰基和疏水基團不斷發生氧化性修飾，并通過共價交聯和疏水相互作用等途徑形成氧化聚集體。Boatright等[41]通過大豆蛋白氧化結構及功能在不同抗氧化劑添加條件下的變化研究中發現，蛋白氧化伴隨著表面疏水性的降低。Liang[42]研究發現即使避光條件下60 ℃的油脂熱氧化也可誘導大豆蛋白氧化進而降低了其表面疏水性。黃友如[43]在大豆蛋白的LOX-亞油酸氧化誘導體系下，大豆蛋白的氧化程度隨誘導反應時間延長逐漸增大，表面疏水性也隨之逐漸降低。研究發現，在大米蛋白氧化模擬體系中發現隨著反應時間的延長，大豆蛋白氧化程度持續增加，表面疏水性逐漸下降[44]。吳偉等[45]研究發現隨著米糠保藏時間延長，米糠發生了氧化酸敗誘導谷蛋白分子結構變化，氧化聚集體逐漸形成進而降低了蛋白表面疏水性，印證了本研究的結論。

2.9 MDA氧化對米糠蛋白粒徑的影響

圖8 MDA氧化誘導米糠蛋白的粒徑分布Fig. 8 Particle size distribution of MDA-oxidized rice bran protein

表3 米糠蛋白樣品的D43和PDITable 3 D43and PDI of oxidized rice bran protein samples

蛋白質氧化誘導的分子交聯及聚集作用下蛋白質分子粒徑趨于變大，通過測定蛋白質粒徑分布（圖8）能直觀地看出蛋白質聚集或降解作用。隨著MDA濃度的增加，分子平均粒徑均逐漸增大。通過粒徑分布圖可知，天然米糠蛋白粒徑主要呈現雙峰分布，其中大蛋白粒徑分布峰歸屬于氧化聚集，而氧化米糠蛋白平均粒徑的增加主要與蛋白聚集體峰的增大有關。由此可以得知，無論低濃度或高濃度蛋白氧化條件下米糠蛋白均發生了氧化聚集效應。但氧化聚集與其他氧化作用對蛋白結構的影響效應相互疊加，是米糠蛋白結構及功能變化的最終原因。而隨著米糠蛋白氧化程度的增加，氧化米糠蛋白粒徑逐漸再聚集形成更大的聚集體。通過粒徑的變化可知，高濃度MDA氧化誘導條件下米糠蛋白除發生不可溶性交聯聚集外，同樣發生了可溶性分子聚集。

多分散指數（polydispersity index，PDI）是衡量溶液分布的均勻程度。蛋白質PDI值越小說明蛋白質溶液越均一，PDI值越大說明溶液中存在蛋白質大小聚集體的分布差距越大。如表3所示，米糠蛋白PDI值隨MDA氧化劑濃度的增加而增大，表明米糠蛋白溶解狀態下分子粒徑分布均一性變差，這主要是由于氧化聚集體所致。汪建明等[46]認為乳蛋白的氧化聚集體分為大粒度聚集體（約1 000 nm）和小粒度聚集體（約100 nm），氧化作用可誘導低粒度聚集體再聚集形成大粒徑聚集體，大粒徑聚集體也解離形成低粒度顆粒，兩種行為同時存在。Promeyrat等[47]認為蛋白質粒徑變化主要與蛋白質分子交聯及聚集有關。黃友如[43]研究發現脂質氧化誘導的蛋白質氧化過程中蛋白質結構解折疊疏水基團外露為蛋白聚集提供了疏水聚集作用力，更多有序二級結構轉化為無序結構過程中氫鍵的重組及分子間范德華力也為蛋白聚集提供了聚集作用條件，受多種分子間交互作用力的誘導，氧化蛋白發生了多重聚集現象，進而形成了大粒徑的蛋白聚集體，是粒徑增大的重要誘因。

2.10 氧化對米糠蛋白質濁度的影響

圖9 MDA氧化對米糠蛋白濁度的影響Fig. 9 Effect of MDA oxidation on turbidity of rice bran protein

蛋白質溶液濁度可以反映蛋白質的聚集程度，可用于側面衡量蛋白質相互作用大小及聚集體的相對尺寸[48-49]。由圖9可知，隨著氧化劑MDA濃度的增加濁度均逐漸增大，這與氧化作用促進米糠蛋白的亞基分子聚集有關，濁度的增加與前述的氧化米糠蛋白粒徑增大相互驗證。MDA氧化的米糠蛋白濁度增大與交聯聚集體及分子聚集體形成有關。黃友如[43]通過脂肪氧合酶催化亞油酸誘導大豆蛋白聚集機理研究中發現，氧化作用誘導了大豆蛋白發生結構解折疊，暴露出更多的疏水基團，并通過疏水相互作用、靜電作用或氫鍵等構建形成較大的聚集體，增加了大豆蛋白的濁度，并伴隨著流體力學半徑分布范圍的擴大。李艷青[50]研究表明羥自由基氧化的鯉魚蛋由濁度隨氧化程度增大濁度逐漸提高。Cui Xuhai等[51]研究發現與天然乳清蛋白相比，經過3、5、10 h羥自由基氧化處理的乳清蛋白濁度分別增加16.9%、22.9%和24.3%。牛思思[52]研究發現，氧化蛋清蛋白的濁度有所增加，并且隨著蛋清蛋白氧化程度的增大，蛋清蛋白的濁度逐漸增加。由此可知，氧化聚集普遍發生于蛋白氧化過程中。

2.11 MDA氧化對米糠蛋白質乳化性和乳化穩定性的影響

如圖10所示，隨著MDA濃度的增高，氧化米糠蛋白乳化性和乳化穩定性呈現逐漸降低的趨勢。這可能是因為隨著MDA濃度的增大，米糠蛋白表面疏水性逐漸降低，米糠蛋白發生疏水性聚集，并且由于活性醛會與蛋白質發生Schiff堿反應生成交聯聚集，氧化米糠蛋白形成可溶和不可溶性聚集體均降低了蛋白分子舒張及乳化界面穩定作用，故米糠蛋白的乳化能力和乳化穩定性均呈現下降趨勢。研究發現，低濃度MDA誘導的大豆蛋白氧化因結構部分解折疊，更多的疏水基團外露增加了大豆蛋白的分子結構柔性，提高了大豆蛋白分子油水界面的吸附結合能力，增加了大豆蛋白的乳化功能，另外大豆蛋白在低濃度丙烯醛氧化誘導下溶解性增加也是乳化性提高的促進因素；而高濃度MDA氧化誘導下大豆蛋白團聚為不可溶性聚集體降低了分子柔性，減少了界面吸附結合面積，降低了大豆蛋白的乳化功能[53]。對比可知，米糠蛋白由于分子交聯作用強于界面舒張解折疊是其乳化功能降低的重要原因。

圖10 MDA氧化對米糠蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig. 10 Effect of MDA oxidation on emulsifying capacity and emulsion stability of rice bran protein

2.12 MDA氧化對米糠蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

圖11 MDA氧化對米糠蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響Fig. 11 Effect of MDA oxidation on foaming capacity and foam stability of rice bran protein

由圖11可見，隨MDA氧化誘導濃度的增加，米糠蛋白的起泡性逐漸降低，這主要是由于雖然兩種蛋白氧化作用均部分解開了米糠蛋白分子結構，分子內部的疏水殘基更多地暴露于蛋白表面，但此條件下過強的米糠蛋白疏水作用促進了分子間聚集，且由于活性醛會與蛋白質反應生成希夫堿則促進了不可溶性交聯聚集體的形成，兩種聚集作用均抑制了米糠蛋白在水氣界面擴展和吸附，降低了米糠蛋白起泡性。目前尚難以解釋MDA氧化誘導米糠蛋白泡沫穩定性隨氧化誘導濃度增大而增強的原因，劉晶等[37]認為部分暴露的疏水性基團可相互吸引，是MDA氧化誘導蛋白泡沫穩定性增強的主要原因。

3 結 論

MDA是食品中脂質過氧化反應中產生最多的活性醛類，由于MDA含有兩個羰基，在一定條件下MDA也可使得蛋白質形成共價交聯[8-9]，使蛋白質的功能特性降低。本研究中，米糠蛋白羰基含量均隨MDA氧化誘導濃度的增加而增大，這主要是由于MDA主要與蛋白質分子中的伯胺加成反應形成烯胺加合物，從而為蛋白質引入羰基基團。MDA分子含有兩個羰基，當其中一個羰基與蛋白質反應時，也會同時為蛋白質引入另一個新的羰基。米糠蛋白α-螺旋和β-折疊含量隨MDA氧化誘導濃度增加逐漸增大，β-轉角結構和無規卷曲結構隨之呈現逐漸降低的變化趨勢，表明氧化使米糠蛋白無序結構轉變為有序結構，這應與氧化誘導的聚集作用有關。隨著MDA氧化誘導濃度的增加，米糠蛋白表面疏水性逐漸下降，熒光λmax發生藍移，表明MDA氧化誘導促進了米糠蛋白氧化聚集，并隨著氧化誘導濃度的增大氧化聚集程度逐漸增加。低氧化誘導濃度下MDA對米糠蛋白亞基組成無顯著影響，隨著MDA氧化誘導濃度增加，分子質量為53、49、36、21、14 kDa的亞基歸屬條帶均有所變淺，條帶逐漸變窄。而隨著氧化誘導濃度的增加，分子質量為36、21、14 kDa的亞基逐漸消失，亞基條帶消失可能與大聚集體的形成及重組有關。通過隨氧化誘導濃度增大氧化米糠蛋白溶解性的逐漸降低及粒徑分布范圍的增大可知，MDA誘導的米糠蛋白氧化聚集并存了可溶性及不可溶性聚集形式，氧化蛋白的自聚集及交聯聚集分別形成可溶性及不可溶性蛋白聚集體，并可以通過熒光分析及表面疏水性分析判斷，氧化聚集是MDA誘導米糠蛋白氧化的主導行為。

結合考慮隨MDA氧化誘導濃度增大米糠蛋白溶解性降低、粒徑增大、濁度增大的變化規律可知，MDA誘導的氧化米糠蛋白可溶性聚集體及不可溶性聚集體含量均隨著氧化濃度的增大而增加，可溶性聚集的粒徑逐漸增加可能是由于蛋白亞基更大程度的聚集所致或新的氧化聚集形成，而不可溶性氧化聚集的增加也可能是由于可溶性聚集體再聚集所致。在本研究中由于氧化交聯形成的不可溶聚集體降低了米糠蛋白的界面延展性，使乳化性、穩定性均有所降低。