混菌發酵蘋果濁汁的益生菌篩選及其發酵動力學模型構建

孟掉琴，吳 霞，岳田利，高振鵬*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，國家楊凌農業綜合實驗工程技術研究中心，農業部農產品質量安全風險評估實驗室（楊凌），陜西 楊凌 712100）

益生菌是指被人體或動物攝入一定數量后，能促進宿主健康的活性微生物[1]，具有調節腸道菌群、降低膽固醇、增強免疫力、緩解口腔疾病及情緒異常等作用[2-4]。目前市場上益生菌發酵產品主要為益生菌發酵乳制品，但由于益生菌發酵乳制品具有乳糖不耐受與高膽固醇兩大不足[5]，開發新的非乳益生菌發酵產品是目前的研究熱點，同時也符合消費者追求食品綠色天然健康的理念。

研究表明果蔬汁是益生菌發酵的良好載體，目前已有對刺梨汁、石榴汁、蘋果清汁及胡蘿卜汁等果蔬汁進行益生菌發酵的研究報道[6-8]。目前國內外研究主要集中于對發酵果蔬汁發酵過程中和貨架期期間理化指標的變化，且發酵菌種多為單菌或雙菌發酵，3 株以上的混合菌株發酵研究較少。其中Dimitrovsk等[9]用植物乳桿菌PSC26發酵蘋果清汁，與對照組相比，發酵過程中添加5%乳清，活菌數明顯增加；Pereira等[10]以干酪乳桿菌發酵腰果蘋果汁，發酵后對貯存穩定性及色值變化等指標進行研究；李維妮等[11]以乳酸菌單一菌種和多菌組合分別發酵蘋果清汁，測定發酵后香氣成分并進行感官評定，研究表明多菌發酵香氣成分含量及感官評分均高于單菌發酵。混菌發酵過程中單菌株既可發揮自身作用，又可通過菌株間協同作用發揮更大價值，生成多種代謝產物，產生多種香氣成分[12]。

由于益生菌發酵蘋果濁汁容易發生褐變、沉淀，因此，相關研究鮮見報道。此外，與蘋果清汁相比，蘋果濁汁膳食纖維的含量明顯增加，濁汁的懸浮果肉顆粒包含果膠、蛋白質、脂肪、半纖維素和纖維素等成分，擁有更柔和的口感、飽滿的風味、豐富的營養價值[13]。對蘋果濁汁進行益生菌發酵，既保留了蘋果濁汁自身營養成分，又包含活的益生菌及發酵所產生的獨特風味與功效，同時使益生菌產品多元化，消費者也有了更多選擇。

目前有關益生菌發酵動力學的研究主要以發酵酸奶為主，益生菌發酵果蔬汁動力學研究甚少。本研究對復合益生菌發酵蘋果濁汁進行菌種篩選，得到較適蘋果濁汁發酵的復合菌種，并對復合菌株發酵蘋果濁汁的菌體生長、產物生成和底物消耗動力學模型進行構建及研究，描述發酵過程動態變化，有效地控制發酵過程，旨在為推動復合益生菌發酵蘋果濁汁的產業化提供一定的技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長富蘋果 陜西楊凌市場；MRS肉湯培養基北京奧博星生物技術有限責任公司。

乳酸菌菌種：副干酪乳桿菌20241（Lactobacillus paracasei）、動物雙歧桿菌 6165（Bifidobacterium animalis）、嗜熱鏈球菌6063（Streptococus thermophilus）、嗜酸乳桿菌 6005（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳桿菌50513（Lactobacillus rhamnosus）、短乳桿菌367（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌21805（Lactobacillus plants）、腸膜明串珠菌22184（Leuconostoc mesenteroides）、發酵乳桿菌 21828（Lactobacillus fermentum）、干酪乳桿菌393（Lactobacillus casei），均保存于西北農林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全控制實驗室。

1.2 儀器與設備

2000JP-1型離心果汁機 南通金橙機械有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HWS-80型智能恒溫恒溫箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蘋果濁汁制備流程

蘋果→清洗→破碎→榨汁（80 目過濾）→護色（0.08%抗壞血酸[14]）→滅酶（90 ℃、15 s[15]）→巴氏殺菌（80 ℃、15 min）

1.3.2 蘋果濁汁發酵

將保存于甘油管的菌株分別置于MRS液體培養基中活化2 代，按1%接種量接種于100 mL蘋果濁汁種子液中，37 ℃靜置發酵18 h，活菌數約達1×107CFU/mL，之后將種子液按3%接種量接種于300 mL蘋果濁汁中，37 ℃靜置發酵24 h，期間定時取樣測定pH值、滴定酸度及活菌數。

1.3.3 指標測定

總酸的測定：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[16]直接滴定法；總糖含量的測定：SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》[17]斐林試劑滴定法；活菌數測定：傾注平板法[18]。

感官評定：9 點快感標度法[19]；對酸甜度、口感、色澤、香氣、整體接受性進行打分，由20 位受過感官訓練的老師和同學組成評定小組，對發酵蘋果濁汁進行感官評價，每項性質都有9 種不同的等級，以表示評定人員對它的喜好程度，1：極度不喜歡；2：極不喜歡；3：中等不喜歡；4：輕度不喜歡；5：無所謂；6：輕度喜歡；7：中等喜歡；8：很喜歡；9：極度喜歡。

1.3.4 益生菌耐酸、耐膽鹽篩選

將10 株菌株從甘油管中接種至MRS液體培養基中，活化2 代。對原菌液的活菌進行計數，同時取1 mL原菌液分別加入到5 mL預先用鹽酸將pH值調至2.5的MRS液體培養基及膽鹽質量分數為0.3%的MRS液體培養基中，置于37 ℃培養箱培養3 h，3 h后對菌液進行計數，比較其耐酸、耐膽鹽能力[19-20]。

1.3.5 益生菌產酸能力篩選

將獲得的耐酸、耐膽鹽菌株以3%的接種量分別接到蘋果濁汁中，37 ℃靜置培養28 h，每隔4 h取樣，分別測定發酵蘋果濁汁中的pH值和滴定酸度，選擇產酸能力強、產酸速率快的菌株進行復篩。

1.3.6 復合菌株間拮抗實驗

采用雙層瓊脂擴散法[21]，將10 μL的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌及發酵乳桿菌的培養液分別與10 mL滅菌后的半固體MRS培養基混合均勻后，立即倒入下層瓊脂培養皿中，待凝固后放入牛津杯，每個牛津杯中加入100 μL稀釋至一定梯度的菌液，37 ℃培養24 h后觀察牛津杯周圍是否出現抑菌圈，若沒有出現抑菌圈說明本底菌與接種菌株無拮抗作用；反之，則說明2 種菌之間存在拮抗作用。

1.3.7 復合菌株比例的確定

將篩選出來的菌株以不同比例按3%接種量于蘋果濁汁發酵基質，在37 ℃發酵24 h，發酵結束后進行感官評定，同時測定發酵后活菌數，確定蘋果濁汁發酵的較佳菌株比例。

1.3.8 動力學模型的建立

根據篩選得到的較佳復合菌株及比例，建立復合菌株發酵蘋果濁汁的菌體生長、產物生成和底物消耗動力學模型，并利用復合菌株發酵蘋果濁汁，每隔2 h測定其活菌數、乳酸生成量及總糖消耗量，計算出動力學模型的參數，預測其發酵過程變化。

1.3.8.1 菌體生長動力學模型的建立

應用Logistic方程[22-23]模擬生長變化趨勢，建立混合菌株在蘋果濁汁發酵過程中動力學模型。生長期細胞的增長速率微分表達式如下：

以t=0、X=Xm為初始條件，將方程（1）積分變形后得方程（2），即：

式中：X0為菌體的初始生物量/（108CFU/mL）；Xm為菌體的最大生物量/（108CFU/mL）；μm為最大比生長速率/h－1；t為時間/h。

將方程（2）積分變形后兩邊同時取對數得：

1.3.8.2 產物生成動力學模型的建立

產物生成速率與細胞生長速率之間的關系有3 種類型：產物生成與菌體生長偶聯型、產物生成與菌體生長部分偶聯型及產物生成與菌體生長非偶聯型[24-25]。根據Leudeking-piret方程[26]：

式中：P為產物質量濃度/（g/L）；X為生物量/（108CFU/mL）；t為時間/h；α為與菌體生長相關聯的產物合成常數；β為與菌體量相關聯的產物合成常數。

混菌發酵蘋果濁汁產乳酸的過程屬于產物生成與菌體生長部分偶聯型，即α≠0，β≠0，此時菌體處于穩定期，即：

以t=0時，P=0為初始條件，積分后得：

1.3.8.3 底物消耗動力學模型的建立

在發酵過程中，底物消耗主要有3 個方面：菌體生長、細胞維持生命活動的消耗及生成代謝產物的消耗[27]。從發酵實驗結果可知，由于發酵過程生成產物所消耗的底物遠遠小于發酵過程中菌體的生長和維持細胞代謝所消耗的底物，因此假設底物消耗用于產物生成的一小部分可以忽略，底物消耗主要用于菌體生長和維持細胞代謝活動[28]。因此采用Luedeking方程來描述底物的消耗情況，其方程見下：

式中：S為產物質量濃度/（g/100 mL）；X為生物量/（108CFU/mL）；t為時間/h；γ為底物消耗參數；δ為底物消耗參數。

將式（2）代入式（7），積分后得：

2 結果與分析

2.1 益生菌發酵蘋果濁汁菌株的篩選

2.1.1 菌株的耐酸、耐膽鹽特性篩選

胃腸道低pH值和高膽汁酸鹽是益生菌能否在人體胃腸道內存活并發揮益生作用的關鍵[29]，因此，篩選出耐酸、耐膽鹽的益生菌是益生菌發酵產品的根本。通過耐酸、耐膽鹽特性篩選研究，能夠較好地反映益生菌在人體胃腸道中的存活的特性。本實驗測定了不同菌株在pH 2.5、膽鹽質量分數0.3%條件下生長3 h后活菌數變化情況，結果如表1 所示。

表1 菌株耐酸、耐膽鹽結果Table 1 Results of tolerance to acid and bile salt in strains

由表1可知，10 株菌株耐酸能力都比較好，只有腸膜明串珠菌22184在pH 2.5條件下3 h后活菌數沒有達到106CFU/mL；動物雙歧桿菌6165、干酪乳桿菌393、鼠李糖乳桿菌50513在3 h后膽鹽耐受性不強，其余菌株都在0.3%膽鹽質量分數下存活率都較高，可以發揮其益生作用。植物乳桿菌21805與發酵乳桿菌21828在pH 2.5的情況下存活率超過100%，說明這兩株菌在酸性條件下還可以生長，耐酸性比較強。副干酪乳桿菌20241、嗜酸乳桿菌6005、短乳桿菌367在0.3%膽鹽質量分數下3 h后存活率均達97%以上，耐膽鹽能力較強。經過實驗篩選，10 株菌中有6 株菌具有良好的耐酸、耐膽鹽特性，它們可以順利通過人體胃腸道，調節人體腸道菌群平衡，具有很好的益生特性。

2.1.2 菌株的產酸能力篩選

pH值是乳酸菌發酵重要的指標之一，常用來表征乳酸菌的產酸能力，一定程度反映其生長代謝過程[30]。本實驗測定了不同菌株隨發酵時間各自pH值變化，如圖1所示。

圖1 不同菌株pH值隨發酵時間的變化Fig. 1 Changes in pH of different strains with fermentation time

由圖1可知，6 株乳酸菌的產酸能力依次為發酵乳桿菌21828＞嗜酸乳桿菌6005＞副干酪乳桿菌20241＞植物乳桿菌21805＞短乳桿菌367＞動物雙歧桿菌6063，6063與367產酸最弱，發酵過程中pH值幾乎沒有變化。6 株菌中副干酪乳桿菌20241、嗜酸乳桿菌6005、植物乳桿菌21805、發酵乳桿菌21828 pH值均呈下降趨勢，在0～4 h pH值變化不明顯，此時處于延滯期，菌株生長緩慢，4 h以后進入對數生長期，酸度迅速上升，pH值下降，其中副干酪乳桿菌20241發酵結束后果汁變黏稠，有不良氣味，不適合蘋果濁汁發酵。因此，確定嗜酸乳桿菌6005、植物乳桿菌21805及發酵乳桿菌21828為較佳的發酵益生菌。

2.1.3 復合菌株間拮抗實驗

為防止復配菌株之間存在抑制作用，影響彼此在蘋果濁汁發酵基質中的作用，本實驗對篩選得到的菌株進行拮抗實驗，實驗結果如表2所示。

表2 菌株間拮抗性結果Table 2 Results of antagonism between strains

由表2可知，3 株菌之間均未出現明顯的拮抗作用，牛津杯周圍無抑菌圈出現，與空白組生長情況一樣，說明3 株菌可以用于復配發酵，可以在蘋果濁汁共同發酵并不會影響各自的生長，因此，這3 株菌可以進行組合發酵蘋果濁汁。

2.1.4 發酵蘋果濁汁復合菌株比例的確定

益生菌發酵制品最重要的評價指標即口感與活菌數[31]，口感好決定其銷售量與受歡迎程度，高活菌數決定其在腸道內的功效。研究表明復合菌株發酵風味、口感均優于單菌發酵[32-33]。本實驗將3 株菌以不同比例接種在蘋果濁汁中進行發酵，對其感官評分及活菌數進行評價，結果如表3所示。

表3 不同菌株比例發酵蘋果濁汁感官評分及活菌數Table 3 Sensory evaluation of fermented samples with different strain ratios

由表3可知，發酵結束后色澤、香氣、組織狀態不同比例之間差異不顯著（P＞0.05），色澤和組織狀態的評分都在7～8 分，說明發酵蘋果濁汁的色澤和組織狀態很受喜歡；酸甜度、口感、整體接受性差異較顯著（P＜0.05），其中1∶1∶1口感及酸甜度得分最高，整體接受性最好，是所有比例中得分情況最優的。其他比例發酵后口感偏酸，評分較低，整體接受性較差。發酵結束后活菌數均可達108CFU/mL，其中1∶1∶1發酵后活菌數最高，可達8.5×108CFU/mL，與其他比例復配活菌數相比，差異顯著（P＜0.05）。綜合感官評價與活菌數結果，最終確定混合菌株發酵復配比例為1∶1∶1。

2.2 動力學參數求解分析

2.2.1 發酵蘋果濁汁動力學曲線

為對復合菌株發酵蘋果濁汁的菌體生長、產物生成和底物消耗動力學模型參數進行計算，本實驗以蘋果濁汁為原料，以嗜酸乳桿菌-植物乳桿菌-發酵乳桿菌1∶1∶1為添加復合發酵劑，研究復合菌株發酵蘋果濁汁，每隔2 h測定蘋果濁汁中的活菌數、乳酸生成量及總糖消耗量變化情況，結果如圖2所示。

圖2 發酵蘋果濁汁動力學曲線Fig. 2 Time-course curves of fermented cloudy apple juice

由圖2可知，總糖含量隨時間延長呈下降趨勢，乳酸含量呈上升趨勢，說明蘋果濁汁中總糖一直在被消耗減少，乳酸生成量也在逐漸增加。在0～4 h，活菌數幾乎沒有變化，此時菌體在適應生長環境，4 h后進入對數生長期，適應環境后菌體生長迅速，大量繁殖；16 h后，菌體生長速度減慢，此時進入穩定期，活菌數趨于平穩。

2.2.2 菌體生長動力模型計算

圖3 擬線性法作圖求Xm和μmFig. 3 Estimation of Xm and μm using quasi-linear method

由此可知μm=0.333 5 h－1，X0=0.258×108CFU/mL，Xm=8.13×108CFU/mL。將參數μm、X0、Xm代入公式（3）得發酵過程中菌體生長動力學模型：

對模型進行非線性擬合，如圖4所示，結果顯示模型顯著，R2=0.997 5，說明該方程與實驗點擬合較好，可以以此方程為參考，作為其生長控制的模型。

圖4 菌體生長動力學模型曲線與實驗值的比較Fig. 4 Comparison of experimental data and kinetic curve of biomass

2.2.3 產物生成動力學模型計算

根據圖2中乳酸生成動力學曲線，接種后0～16 h是菌體生長期，16 h后是菌體生長穩定期，即乳酸生成穩定期，這個階段圖，得到二者關系：P=0.017 3t＋0.332，相關系數R2為0.980 5，由公式（5）可知：0.002 1。

將參數μm、X0、Xm、β代入公式（6），以P—βB（t）對A（t）作圖，如圖5所示，得到兩者關系為：P—βB（t）=0.009 9A（t），R2=0.852 4，因此α=0.009 9。

圖5 擬線性法作圖求αFig. 5 Estimation of α using quasi-linear method

將μm、X0、Xm、β、α代入公式（6）得乳酸生成動力學模型：

2.2.4 底物消耗動力學模型計算

根據圖2中底物總糖消耗變化實驗數據，取菌體生長穩定實驗值，以基質總糖質量濃度S對時間t作圖，得到兩者關系為：S=－0.046 1t＋10.201，相關系數R2為0.991 3。由公式（8）可得0.046 1/8.13=0.005 7。

將參數X0、Xm、δ代入公式（9），以S0—S—δD（t）對C（t）作圖，如圖6所示，兩者的關系為：S0—S—δD（t）=0.093 2D（t），相關系數R2為0.938 3，因此γ為0.093 2。

圖6 擬線性法作圖求γFig. 6 Estimation of γ using quasi-linear method

將參數μm、X0、Xm、δ、γ代入公式（9）得葡萄糖消耗動力模型：

2.2.5 模型驗證

為檢驗建立模型的可靠性，對發酵實驗值與模型的理論值進行比較，如表4所示。

由表4可知，模型理論值與實驗值誤差均小于10%，說明建立的模型理論值和實驗值符合性較好，本研究構建的動力學模型能夠很好地描述復合益生菌發酵蘋果濁汁的菌體生長變化規律。

表4 模型理論值與實驗值的比較Table 4 Comparison between experimental data and model calculation

3 結 論

根據10 株益生菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性及產酸特性篩選得到較佳益生菌發酵蘋果濁汁的復合菌株組合為嗜酸乳桿菌6005、植物乳桿菌21805、發酵乳桿菌21828，并通過感官評定及活菌數得到3株益生菌菌株比例為1∶1∶1時，發酵蘋果濁汁口感風味較佳，可接受性較好，活菌數最高。

構建復合益生菌發酵蘋果濁汁菌體生長、產物生成及底物消耗動力學模型，并根據益生菌發酵蘋果濁汁動力學曲線得到模型參數并對模型進行驗證，對模擬值與實驗值進行比較，誤差均小于10%，相關性極顯著，說明建立的模型可以系統地描述發酵過程，能夠很好地預測復合益生菌發酵蘋果濁汁發酵過程變化情況。