HPLC測定番荔枝果實中酚類成分及抗氧化相關性

韓 銳，陳亞運，季君洋，陳 勇，李 祥*，陳建偉

（南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023）

番荔枝為番荔枝科（Annonaceae）番荔枝屬（Annona Linn.）植物番荔枝（Annona squamosa Linn.）的成熟果實，又名佛頭果、釋迦，為熱帶水果[1]。原產于美洲，現在我國南方部分地區廣東、廣西、福建、海南等地均有引種。番荔枝具有極高食用藥用價值，果實可治惡瘡腫瘍，補脾[2]。現代藥理研究表明具有免疫抑制、抗菌、抗病毒、殺蟲、抗瘧、抗腫瘤[3-7]等功效，其根治急性赤痢、精神抑郁、抗驚厥[8-9]。番荔枝富含多種化學成分，包括生物堿、萜、多酚、黃酮、糖、蛋白質、氨基酸和人體所需多種微量元素等[10-13]。

天然酚類化合物主要存在于植物組織的初生壁與次生壁中，各植物組織不同部位及發育階段所含種類及含量也不盡相同，其生長環境也會造成影響。研究發現酚類具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁、抗焦慮、抗肥胖[14-19]等生物學特性。

目前人們對番荔枝果實成分及藥理活性研究較多，但對果實各部位中酚類化合物的含量及抗氧化活性研究較少。本實驗以6 個產地番荔枝果實為研究對象，分別對果皮、果肉、種子及抗氧化活性進行對比研究，揭示不同部位中酚類物質分布、含量及抗氧化活性差異，為番荔枝果實開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番荔枝分別于2018年1月購自福建漳州（FJ）、海南三亞（HN）、越南西貢（YX）、廣東汕頭（GD）、廣西南寧（GX）和云南西雙版納（YN），經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為番荔枝科番荔枝屬植物番荔枝的果實。

沒食子酸（批號：110831-200302）、原兒茶酸（批號：110809-201205）、兒茶素（批號：110877-200001）、咖啡酸（批號：110885-200102）、表兒茶素（批號：110878-200102）、阿魏酸（批號：110773-201313）、蘆丁（批號：100080-201409）、山柰素（批號：110831-200302） 國家食品藥品檢定研究院；新橙皮苷（批號：10477-201203） 南昌貝塔生物科技公司；槲皮素（批號：20151016） 北京Solarbio公司；對羥基苯甲酸（批號：131021）、柚皮素（批號：131105） 上海融禾醫藥科技發展有限公司；牡荊素（批號：PO6J7F17386）、Trolox（批號：MO8J7E17493）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物技術有限公司；2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，ABTS） 上海浩然生物技術有限公司；K2S2O8上海麥克林生化科技有限公司；標準品純度均大于98%。

甲醇（分析純） 江蘇漢邦公司；乙腈（色譜純）德國默克公司；甲酸（分析純） 南京化學試劑公司；乙醇（分析純） 上海實意化學公司；二甲基亞砜（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；BT125D電子天平 德國Sartorius公司；KH-500DB型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；400Y打粉機 永康鉑歐五金公司；SAGA-10TQ EPED超純水儀 南京易普易達科技發展有限公司；Alliance e2695高效液相色譜儀 美國沃特世公司；TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國安捷倫公司；SpectraMax 190多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；Allegra X-30R Centrifuge冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；Alpha-1502型紫外分光光度計 上海譜元儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液制備

取6 個產地新鮮成熟的番荔枝用自來水清洗干凈，剝離果皮、果肉及種子部位。于真空冷凍干燥機中干燥，打粉，過60 目篩。稱取1.00 g番荔枝果皮、果肉、種子粉末于10 mL試管中，加入體積分數70%甲醇溶液5 mL，超聲60 min后，用70%甲醇溶液補足質量。提取液于14 800×g離心10 min后，取上清液于－20 ℃冰箱中保存、備用。每個產地平行3 次實驗。

1.3.2 標準品溶液制備

分別稱取沒食子酸5.02 mg、原兒茶酸5.01 mg、對羥基苯甲酸5.29 mg、咖啡酸5.27 mg、兒茶素4.93 mg、表兒茶素5.06 mg、阿魏酸5.24 mg、蘆丁4.99 mg、新橙皮苷4.97 mg、牡荊素5.03 mg、槲皮素5.15 mg、柚皮素4.88 mg、山柰素5.15 mg，加甲醇溶解，于5 mL容量瓶中定容。其中柚皮素、蘆丁、槲皮素需加入少量二甲基亞砜助溶。各吸取0.5 mL單酚標準品于10 mL容量瓶中，混勻、定容即得混合標準品。將配制好的標準品于14 800×g離心10 min，取上清液于－20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3 總酚含量測定

采用福林-酚比色法測定總酚含量[20-21]。

標準曲線的建立：取配制的沒食子酸溶液（1.00 mg/mL），逐級稀釋成10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/mL沒食子酸溶液。取0.5 mL標準品溶液，加入2.5 mL 10%福林-酚試劑，5 min后加入2 mL的5%碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應1 h，于波長765 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標（y），質量濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線。

樣品含量測定：取6 個產地果皮、果肉、種子部位提取液，取1 mL進行稀釋。以標準曲線方法進行測定。其吸光度帶入標準曲線算出總酚質量濃度C。按公式（1）計算總酚含量：

式中：C為樣品中總酚質量濃度/（mg/mL）；V為稀釋體積/mL；D為稀釋倍數；M為樣品質量/g。

1.3.4 單酚含量測定

1.3.4.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；洗脫程序：A相為0.5%甲酸溶液，B相為乙腈（0 min，A∶B=95∶5；25 min，A∶B=90∶10；40 min，A∶B=85∶15；70 min，A∶B=78∶22；90 min，A∶B=65∶35；95 min，A∶B=95∶5）。紫外檢測器，檢測波長為272 nm。

1.3.4.2 標準曲線制作

取1.3.2節制備的標準品溶液進行逐級稀釋并進行色譜分析。以峰面積為y軸，以標準品質量濃度為x軸，建立回歸方程。以3 倍信噪比確定檢出限。

1.3.4.3 樣品單酚含量測定

取1.3.1節制備的樣品溶液進行色譜分析，以積分峰面積帶入各單酚標準曲線中計算含量。

1.3.5 HPLC方法學考察

1.3.5.1 精密度

取混合標準品溶液，進行色譜分析，連續測定5 次，記錄色譜峰的峰面積，根據各標準品的峰面積，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5.2 穩定性

取果皮、果肉和種子部位提取液，分別在0、6、12、24 h進樣，按1.3.4.1節色譜條件下，測定峰面積，根據峰面積計算RSD。

1.3.5.3 重復性

取果皮、果肉和種子部位提取液，按1.3.4.1節色譜條件進樣，連續測定5 次，根據峰面積計算各單酚的含量，計算RSD。

1.3.5.4 加樣回收率

分別稱取番荔枝果皮、果肉、種子1.000 0 g，按照1.3.1節方法對樣品進行處理，分別精密加入對照品適量。在1.3.4.1節色譜條件下，對加標準品的樣品和未加標準品的樣品進行檢測，記錄每組峰面積，按公式（2）計算回收率，平行6 次計算RSD。

式中：A為加標準品的樣品峰面積；A0為標準品峰面積；Ax為樣品峰面積。

1.3.6 抗氧化實驗

1.3.6.1 清除DPPH自由基[22-23]

稱取DPPH 2 mg溶于約20 mL甲醇中。取樣品溶液，果皮部位分別稀釋成相對藥材質量濃度分別為0.098、0.20、0.39、0.78、1.56、3.13 mg/mL的溶液；果肉部位稀釋成質量濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、10.42、20.83 mg/mL的溶液；種子部位稀釋成質量濃度分別為1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 mg/mL的溶液。

取樣品50 μL加入96 孔板中，加入100 μL DPPH溶液，振搖10 s，避光靜置30 min，于519 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按公式（3）計算：

式中：A0為50 μL甲醇＋100 μL DPPH溶液的吸光度；A為50 μL樣品＋100 μL DPPH溶液的吸光度。

1.3.6.2 清除ABTS陽離子自由基[24-25]

ABTS工作液配制：將ABTS配成濃度為7.4 mmol/L的溶液，K2S2O8配成濃度為2.6 mmol/L的溶液，各取1 mL等體積混合后，于室溫避光12 h。用95%乙醇溶液將溶液稀釋至40～50 倍，在734 nm波長處測定吸光度，使其吸光度在0.7±0.02范圍內，即為配制好的ABTS工作液。

樣品溶液配制：取1.3.1節制備的樣品溶液，果皮部位稀釋成相對藥材質量濃度為0.024、0.049、0.098、0.20、0.39、0.78 mg/mL的溶液；果肉與種子部位同

1.3.6.1 節稀釋。

清除ABTS陽離子自由基能力測定：在96 孔板中加入30 μL樣品和120 μL ABTS工作液，振搖10 s，避光靜置6 min，于波長734 nm處測定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率按公式（4）計算：

式中：A0為120 μL ABTS工作液＋30 μL甲醇的吸光度；A為120 μL ABTS工作液＋30 μL樣品的吸光度。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次，結果以 ±s表示，用Excel建立數據庫。利用SPSS 23.0統計軟件完成方差分析和相關性分析。采用GraphPad Prism 6軟件進行數據統計分析與圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 HPLC方法學考察結果

表1 13 種酚類物質的方法學考察結果Table 1 Methodological study of the PLC method for the determination of 13 phenols %

表1 13 種酚類物質的方法學考察結果Table 1 Methodological study of the PLC method for the determination of 13 phenols %

化合物 RSD（n=5） 回收率（n=6）精密度 穩定性 重復性 平均回收率 RSD沒食子酸 0.72 1.07 0.87 92.89 2.36原兒茶酸 0.83 1.59 2.13 97.91 1.59對羥基苯甲酸 0.39 2.28 1.09 95.18 3.01兒茶素 1.91 1.34 0.65 92.99 1.48咖啡酸 0.52 1.43 2.35 90.50 2.56表兒茶素 1.32 2.23 1.67 95.14 0.68阿魏酸 1.01 2.22 0.97 103.67 2.09牡荊素 1.55 2.97 1.36 100.26 3.33蘆丁 1.78 2.91 2.64 95.02 2.76新橙皮苷 2.67 1.92 2.21 100.31 2.92槲皮素 0.97 1.26 1.57 97.26 1.08柚皮素 0.52 2.63 2.09 91.42 1.89山柰素 1.14 2.23 3.27 100.07 2.06

如表1所示，HPLC方法學考察結果表明儀器精密度良好，HPLC條件穩定性、重復性和加樣回收率均符合常規定量分析要求。

2.2 番荔枝果實總酚含量

根據沒食子酸制作的回歸方程y=0.012 3x－0.086 5，R2=0.999 9。在質量濃度10～50 μg/mL呈良好線性關系。果實中果皮部位總酚含量均顯著高于果肉和種子部位。果皮部位中GX含量最高；果肉部位YN和HN總酚含量相對較高；種子部位總酚含量均較低。綜上所述，各部位總酚含量差異性顯著為果皮＞果肉＞種子，GX果實各部位總酚總量最高。

2.3 番荔枝果實單酚含量

2.3.1 單酚標準曲線

表2 對照品回歸方程及檢出限Table 2 Regression equations and detection limits

如表2所示，13 種單酚均呈現良好線性關系，相關系數在0.999 1～0.999 9之間，檢出限范圍為0.20～0.41 μg/mL。

2.3.2 單酚含量測定結果

如圖1、表3所示，6 個樣品中番荔枝果實中果皮、果肉、種子部位中所含單酚含量及種類差異顯著。果皮中兒茶素與表兒茶素含量相對較高，GX兒茶素含量最高，對羥基苯甲酸、表兒茶素與新橙皮苷相對高于其他單酚。果肉中單酚種類和含量差異均較顯著，對羥基苯甲酸與表兒茶素含量相對高于其他單酚，GX所含單酚種類最少為6 種，且總酚含量相對較低，YX總酚含量最低。種子部位HN所含種類最多為9 種單酚，其中蘆丁含量最高，其次是表兒茶素。YX種子所含種類最少只有5 種單酚。YX和FJ果皮與果肉中均未檢測到槲皮素、柚皮素、山柰素3 種單酚，種子中均未檢測到沒食子酸與原兒茶酸。果皮中所含單酚總量顯著高于果肉與種子部位。

表3 番荔枝果實單酚含量（n=3）Table 3 Comparison of individual phenol contents in A. squamosa fruit (n=3)

圖1 單酚HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of individual phenolic compounds

2.4 抗氧化實驗結果

2.4.1 清除DPPH自由基

圖2 果實酚類提取液對DPPH自由基的清除能力Fig. 2 DPPH radical scavenging activities of different fruit parts

由圖2可知，番荔枝果實具有顯著的抗氧化活性，且果皮部位清除DPPH自由基能力顯著高于果肉和種子部位，這與Kingsley[26]和Henrique[27]等研究結果一致。果皮部位中，GX果皮抗氧化活性最好，其次是YX，FJ抗氧化能力最差。果皮在質量濃度為1.56 mg/mL時均達到最大清除率，而GX與YX果皮質量濃度僅為0.39 mg/mL達到最大。而在果肉部位中GX果肉抗氧化能力較差，YN效果最好且顯著優于其他5 個樣品。種子部位中，GX抗氧化能力最佳，GD顯著低于其他組樣品。

2.4.2 清除ABTS陽離子自由基

圖3 果實酚類提取液對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig. 3 ABTS radical cation scavenging activities of different fruit parts

由圖3可知，番荔枝果實各部位清除ABTS陽離子自由基能力明顯優于DPPH自由基。果實各部位間抗氧化能力差異顯著，果皮抗氧化效果最佳，種子部位最差。GX果皮清除ABTS陽離子自由基能力最強，其次是YX，FJ和GD均較差。在果皮質量濃度為0.20 mg/mL時，除FJ和GD均達到最大清除率約85.00%。果肉部位YN抗氧化能力顯著高于其他樣品，其次為HN，FJ、GD、YX、GX四個樣品果肉抗氧化能力相當均較差。種子部位中GD效果較差，其他5 個樣品抗氧化效果優于GD，但無顯著性差異。

2.5 番荔枝果實酚類物質抗氧化能力與酚類物質含量相關性分析

表4 番荔枝果實酚類物質抗氧化能力與酚類物質含量相關性分析Table 4 Correlation coefficients between antioxidant activity and phenolic contents

以清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的IC50值和各酚類物質含量進行相關性分析，IC50值越小其抗氧化能力越強。如表4所示，植物酚類提取液的抗氧化作用不是由一種物質單獨作用的結果，而是多種物質之間的協同作用，既與總酚相關又與單酚存在一定的關聯性。果皮中總酚含量與清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基均達到極顯著相關。果肉部位中表兒茶素、總酚含量與抗氧化能力達到顯著相關。種子部位抗氧化能力與總酚含量存在一定的關聯性，柚皮素與山柰素對抗氧化能力的貢獻較大。與Kelebek[28]和Zahid[29]等報導一致，抗氧化活性與酚類化合物存在一定的相關性，且與總酚含量達到顯著相關。但與本實驗結果不同的是張華等[30]研究發現單酚中沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸對抗氧化活性貢獻較大，可能與實驗采用的樣本含量較低所致。

3 結 論

番荔枝果實不同部位間酚類成分種類及含量差異顯著。果皮部位總酚及單酚總量明顯高于果肉和種子部位。果皮中兒茶素與表兒茶素含量較高；果肉中羥基苯甲酸與表兒茶素較高；種子中各單酚含量均較低。番荔枝果實具有顯著的抗氧化活性，且清除ABTS陽離子自由基能力顯著強于DPPH自由基，不同部位間抗氧化活性差異顯著，果皮＞果肉＞種子。果皮與種子中GX抗氧化效果均較好，果肉中YN抗氧化活性顯著高于其他樣品。相關性分析表明抗氧化活性是多種物質之間的協同作用，與總酚存在顯著相關。

本實驗通過對番荔枝果實果皮、果肉和種子中總酚、單酚的含量測定，建立同時測定番荔枝果實中13 種酚類物質的方法，且操作簡便，重復性好，可用于三者之間酚類物質的含量測定。又對番荔枝果實各部位酚類提取液抗氧化活性進行對比，與Adefegha等[31]報道一致，果皮酚類含量最高，且抗氧化活性顯著高于果肉和種子部位。研究發現番荔枝果皮多酚顯著的抗氧化活性，可能是其發揮抗II型糖尿病、高血壓和肝保護的作用機制之一[32-33]。而果皮作為食用廢棄物，且毒副作用小，可作為天然抗氧化劑，此研究為番荔枝果皮的開發利用提供可能。