高效液相色譜-串聯質譜聯用法與高效液相色譜法同步測定白玉菇麥角固醇和VD2方法比較

徐明芳，沈林燕，楊云舒，傅利軍，孫 勇,*，王洋洋，彭 璐，黃曉晶，李 彥

（1.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2.北京食品科學研究院，北京 100068）

白玉菇又稱白玉蕈、白色真姬菇（white Hypsizigus marmoreus），是真姬菇（H. marmoreus）的一個白色變種，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaicales），白蘑科（Tricholomataceae），玉蕈屬（Hypsizigus），菇體潔白清亮，質地緊密脆嫩，口感滑膩鮮美，是一種深受全世界消費者喜愛的上乘山珍，享有食用菌中的“金枝玉葉”的美稱[1]。麥角固醇（又稱麥角甾醇）是白玉菇中重要的生物活性物質，其化學名稱為24β-甲基膽固醇-5,7烯-3β-羥基（圖1A），具有與膜結合酶的活性，對確保膜結構的完整性、流動性、細胞活力、物質運輸等方面起著重要作用，還是一種重要的化工原料，可用于“可的松”、“黃體酮”等藥物的生產[2]。

研究[3-5]發現麥角固醇對腫瘤細胞的生長具有顯著的抑制作用，可作為有效的抗癌物質。此外，麥角固醇還是VD2的前體化合物，在受到紫外光照射時，分子中一個碳環發生斷裂，轉化為VD2[6-8]。VD2又稱麥角鈣化甾醇，化學名稱為9,10-開環麥角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇，化學結構式如圖1B所示，是麥角固醇的同分異構體，能調控鈣、磷代謝和骨穩態，促進孕婦和老年人對鈣磷的吸收[9-11]，影響細胞的增殖分化[12-13]，對調節生命代謝功能有重要作用。

圖1 麥角固醇（A）和VD2（B）結構式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麥角固醇的檢測方法主要有紫外分光光度法法[14-16]、薄層色譜掃描法[17-18]、高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[19-21]法和氣相色譜法[22-23]等，VD2常采用HPLC法[24-26]。文獻報道的方法均為麥角固醇或VD2單一組分的測定，如研究者[27-29]分別用HPLC和氣相色譜法分析栽培蘑菇中VD2和麥角固醇的含量，發現栽培蘑菇中都含有豐富的麥角固醇，卻幾乎沒有VD2。麥角固醇和VD2之間特殊的光轉化關系導致食用菌中兩者的含量存在動態變化，建立同步定量檢測麥角固醇和VD2的分析方法對白玉菇中有效成分的質量控制及食用菌相關新產品的研發具有重要的意義。基于HPLC-MS/MS高效分離能力、高分辨率和高靈敏度技術優勢[30-31]，本研究通過兩種方法中檢測條件的優化與方法學評價，旨在建立HPLC-MS/MS法快速準確同步檢測白玉菇中麥角固醇與VD2的檢測方法，為食用菌新產品研發與質量標準完善提供理論依據與技術方法，對于開展同分異構體的同步檢測具有重要現實意義與理論價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮白玉菇（市售），經干燥、研磨成粉末狀后備用；麥角固醇、VD2標準品（純度＞98%） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚（均為分析純）廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水（18.2 MΩ/cm） 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設備

ABI4000 Q TRAP型HPLC-MS/MS聯用儀 美國應用生物系統公司；1100 HPLC儀（配二極管陣列檢測器及數據分析平臺） 美國Agilent公司；超純水儀 美國Thermo Scientific公司；烘箱 上海福瑪實驗設備有限公司；旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；CP224C電子天平 奧豪斯儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兩種方法檢測條件

HPLC-MS/MS聯用法：電噴霧離子源正離子檢測方式下采用多反應選擇離子監測（multi-reaction monitoring，MRM）模式進行二級質譜分析。色譜柱：Agilent SB-C8Rapid Res長柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流速：500 μL/min（50 mm C8）、250 μL/min（100 mm C8）；流動相：100%甲醇；柱溫：22 ℃；進樣量：5 μL/min；離子源參數：霧化氣壓力310.3 kPa，輔助氣壓力413.7 kPa；氣簾氣壓力137.9 kPa；離子源溫度500 ℃，離子源噴霧流速5 L/min。

HPLC法：COSMOSIL Column 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相100%甲醇；流速1 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；運行時間15 min。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取麥角固醇標準品30.00 mg，VD2標準品10.00 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容、搖勻，即得麥角固醇質量濃度為3 mg/mL、VD2質量濃度為1 mg/mL的標準品儲備母液。將母液用無水乙醇依次稀釋配制成HPLC-MS/MS聯用法和HPLC法所需質量濃度的混合標準溶液。以麥角固醇及VD2標準品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 供試品溶液的制備

取市售鮮白玉菇子實體適量，烘干，研碎，取1 g干粉置于磨口燒瓶，加40 g/L的NaOH溶液25 mL，再加入50 mL無水乙醇，在85 ℃水浴中皂化回流90 min。皂化完畢，濾紙過濾皂化液，冷卻至室溫，加25 mL石油醚，充分振蕩15 min，靜置分層。上層無色萃取液用旋轉蒸發儀45 ℃時蒸去石油醚，蒸干后樣品用無水乙醇定容到10 mL容量瓶，供試品溶液測定前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.4 樣品中麥角固醇、VD2含量的計算

式中：C1、C2分別為麥角固醇、VD2質量濃度；V1、V2分別為麥角固醇、VD2的定容體積；N1、N2分別為麥角固醇、VD2的稀釋倍數；W1、W2分別為麥角固醇、VD2萃取時樣品的干質量。

1.4 統計分析

采用SPSS 19軟件進行數據統計分析，采用Excel軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 HPLC-MS/MS聯用法檢測條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱柱長可能會影響混合物組分的分離效果和分離時間[32]，研究Agilent SB-C8Rapid Res長柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）對白玉菇樣品中麥角固醇和VD2的分離情況，結果如圖2、3所示。比較樣品MRM色譜圖發現，C8短柱與C8長柱均能獲得良好的分離度和色譜峰形，色譜峰窄且尖銳，C8短柱的響應信號較C8長柱稍弱，但與長柱相比，僅需4.5 min左右即可實現對兩種組分的快速分離，基于此，后續實驗選用50 mm C8柱進行同步檢測。

圖2 100 mm C8柱中麥角固醇（A）和VD2（B）的分離MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 100 mm long C8 column

圖3 50 mm C8柱中麥角固醇（A）和VD2（B）的分離MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 50 mm long C8 column

2.1.2 質譜分析參數優化

采用電噴霧離子源正離子模式對麥角固醇和VD2標準品進行全波掃描，確定麥角固醇和VD2母離子參數，調整氣簾氣電壓、霧化氣流速、輔助氣壓力、離子源溫度等參數，降低噪音，提高母離子穩定性和響應信號，優化錐孔電壓、碰撞電壓、攝入電壓及碰撞室射出電壓等參數（表1），MRM模式下進行質譜分析。

表1 麥角固醇及VD2的質譜分析參數Table 1 Mass spectrometric parameters of ergosterol and VD2

在一級質譜圖中從特征母離子中選擇適宜的子離子，根據MRM模式下進行二級質譜分析，使母離子的響應信號降低，子離子的響應信號增強，結果如圖4、5所示。

圖4 麥角固醇的一級（A）、二級（B）質譜子離子掃描圖Fig. 4 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of ergosterol

圖5 VD2的一級（A）、二級（B）質譜子離子掃描圖Fig. 5 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of VD2

2.1.3 定量離子對的選擇

圖6 不同離子對VD2和麥角固醇的分離MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of VD2 and ergosterol with different ion pairs

麥角固醇與VD分子結構中多為烷烴和烯烴的組合（圖1），轟擊產生的離子碎片較多，且難發現明顯的特征離子對。麥角固醇與VD2在MS1＋掃描中主要生成[M＋H－H2O]＋準分子離子峰m/z 379.3（圖4A）與397.3（圖5A），對兩者進行MS2＋掃描，生成信號較高的主要碎片離子，如麥角固醇二級特征離子m/z為125.3、253.3（圖4B）、VD2的二級特征離子m/z 125.3、271.3（圖5B）。實驗表明，如果選用m/z 69.2、107.2等低質量端的離子容易產生干擾，通常選擇豐度較高且干擾小的離子作為特征離子，兩種物質二級質譜圖中含有相同的特征離子m/z 125.3，推測為同一烯烴碎片離子C9H17＋，可作為同步檢測麥角固醇與VD2定性定量依據。

從圖6可知，選用不同離子對計算出來的麥角固醇與VD2含量并無顯著差異，選用m/z 397.3/271.3離子對定量VD2時MRM色譜圖的雜峰比選用m/z 397.3/125.3多，導致基線極不平穩，選擇m/z 397.3/125.3作為VD2定量離子對，m/z 379.3/125.3作為麥角固醇定量離子對，通過組內、組間方差分析，研究結果并無顯著差異（表2、3）。

表2 離子對的選擇對VD2和麥角固醇測定結果的影響Table 2 Effect of different ion pairs on VD2and ergosterol contents

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance

2.2 HPLC法檢測條件的優化

2.2.1 流動相流速選擇

柱效是柱中流動相線性流速的函數，不同的流速可得到不同的柱效。對于特定的色譜柱，要獲得最佳柱效需采用最佳流速。流動相流速研究結果如表4、5所示。

表4 麥角固醇/VD2混合標準品在不同流動相配比下的保留時間、響應信號和峰面積Table 4 Retention time, response signal and peak area of ergosterol/VD2mixed standard solution at different mobile phase compositions

由表4可知，隨著甲醇比例的增加，保留時間隨之縮短，信號響應值隨之增加，峰面積基本接近，選用100%甲醇作為流動相，保留時間短，響應信號值高，分離效果較好。

表5 麥角固醇/VD2混合標準品在不同流速下的保留時間、響應信號和峰面積Table 5 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different flow rates

由表5可知，流速為0.8 mL/min時，保留時間較長；流速為1.2 mL/min時，標準品的峰面積相對較低，流動相流速選取為1 mL/min時，標準品的保留時間和峰面積適中。

2.2.2 柱溫的選擇

表6 麥角固醇/VD2混合標準品在不同柱溫下的保留時間、響應信號和峰面積Table 6 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different column temperatures

從表6可知，隨著柱溫的升高，麥角固醇和VD2的保留時間與響應信號略有變化，柱溫選擇30 ℃時麥角固醇和VD2的峰面積較高。

HPLC條件優化為波長270 nm、100%甲醇、柱溫30 ℃、流速1 mL/min、進樣量10 μL時，麥角固醇和VD2單標與混標保留時間都如圖7所示，色圖譜基線平穩，峰形尖銳對稱，主峰與其他色譜峰實現較好分離，所有樣品在15 min內檢測完畢。

圖7 麥角固醇、VD2單標（A）和混合標準溶液（B）HPLC譜圖Fig. 7 HPLC chromatograms of VD2, ergosterol standards (A) and mixed standard (B)

2.3 兩種同步檢測方法學的評價

2.3.1 線性方程、檢出限與定量限

一定范圍濃度的麥角固醇和VD2標準溶液采用優化檢測條件下建立的HPLC-MS/MS聯用法及HPLC法進行測定，并進行線性回歸，按3 倍信噪比和10 倍信噪比計算方法分別確定檢出限和定量限，參數與結果見表7。

表7 HPLC-MS/MS及HPLC方法的線性回歸參數Table 7 Overview of the linearity data obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

如表7所示，HPLC-MS/MS聯用法中，在質量濃度0.15～6 mg/L與0.01～1 mg/L范圍內，標準品麥角固醇與VD2濃度均與峰面積呈現良好的線性關系；HPLC法中，標準品麥角固醇質量濃度在15～750 mg/L與VD2質量濃度在0.5～50 mg/L范圍內，均與峰面積呈現良好的線性關系。與HPLC法相比，HPLC-MS/MS聯用法檢出限、定量限與檢測時間均低于HPLC法。

2.3.2 重復性評價

同一混標樣品取3 份精密稱定1 g，制備樣品溶液。用兩種檢測方法分別測定VD2和麥角固醇含量，記錄峰面積積分值，按照各自的標準方程計算含量及其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，結果如表8所示，數據表明兩種檢測方法具有良好的重復性，但對于低濃度的VD2檢測，HPLC法缺乏有效性。

表8 HPLC-MS/MS及HPLC方法的重復性實驗結果Table 8 Results of repeatability obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

2.3.3 加標回收率與儀器精密度

分別精確稱定1 g已知VD2和麥角固醇含量的樣品3 份準確加入一定量的VD2和麥角固醇標準品，按照樣品處理方法制備樣品溶液。用兩種檢測方法分別測定VD2和麥角固醇含量，按外標法以峰面積計算含量，結果如表9所示。兩種檢測方法RSD低于均低于6%。

表9 HPLC-MS/MS的VD2回收率實驗結果（n=3）Table 9 Recovery of VD2by HPLC-MS/MS (n= 3)

2.3.4 日內和日間精密度實驗結果

配制高中低麥角固醇和VD2標準品溶液，每天進樣3 次連續測定3 d，記錄麥角固醇和VD2的峰面積積分值，計算各自峰面積的RSD計算日間和日內差異，結果如表10所示。

表10 HPLC-MS/MS及HPLC方法的日內和日間精密度實驗結果Table 10 Results of intra-day and inter-day precision obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

由表10可見，較高質量濃度范圍內，HPLC法日內和日間精密度較高，RSD均低于1%，低質量濃度的檢測HPLC-MS/MS聯用法更具優勢，低、中、高3 個水平的麥角固醇和VD2標準品日內和日間精密度實驗結果的RSD均低于7%，表明兩種方法精密度良好。

2.4 樣品檢測與系統適應性

圖8 白玉菇樣品中VD2和麥角固醇HPLC色譜圖Fig. 8 Chromatograms of VD2 and ergosterol in white H. marmoreus sample

從圖8可知，麥角固醇與VD2分別在12.701 min與9.828 min出峰，峰后有少量雜峰但不影響麥角固醇與VD2的定性與定量分析。

白玉菇樣品中麥角固醇和VD2MRM色譜圖如圖9所示，供試品溶液中雖有微量的雜質峰干擾，但對樣品測定無影響，建立的兩種檢測方法專屬特異性強系統適應性好。

圖9 白玉菇樣品中麥角固醇（A）和VD2（B）MRM色譜圖Fig. 9 MRM chromatogram of ergosterol (A) and VD2 (B) in white H. marmoreus sample

市售3 種不同廠家的白玉菇樣品采用上述兩種方法測定，白玉菇中麥角固醇和VD2的含量結果見表11。

表11 不同廠家市售白玉菇中麥角固醇和VD2兩種檢測方法測定結果比較（n=3）Table 11 Comparison of results obtained for determination of ergosterol and VD2by HPLC-MS/MS and HPLC in commercially available white H. marmoreus from different manufacturers (n= 3)

市售白玉菇樣品檢測結果（表11）可知：HPLC-MS/MS法可以有效檢測麥角固醇與微量的VD2；HPLC法僅能測定麥角固醇含量，含量高于HPLC-MS/MS法，且無法檢測出白玉菇樣品中微量的VD2含量，兩種方法的檢測結果存在一定的差異性，從測定原理看，HPLC-MS/MS是采用HPLC系統將物質分開后，經質譜檢測系統，使各組分電離成不同m/z的離子，通過分析離子化樣品的m/z實現對被測化合物定性定量分析；HPLC是一種以液體為流動相的色譜系統，待測樣品隨流動相進入裝有固定相的色譜柱，在柱內利用液-液分配或吸附作用實現待測組分的分離進入二極管陣列檢測器檢測，以標準物質的HPLC色譜和保留時間定性，峰面積定量。研究結果與測定效率表明，HPLC-MS/MS高分辨率與高靈敏度和定性定量能力，與HPLC法相比，具有更低的檢出限，更短的檢測時間。

3 結 論

本實驗建立HPLC-MS/MS與HPLC兩種同步檢測白玉菇樣品中麥角固醇和VD2含量方法與方法學評價，通過對市售白玉菇樣品中麥角固醇和VD2含量進行檢測與系統適應性分析，對比兩種方法檢測的差異性。HPLC-MS/MS方法則具有更高分離和定性定量的能力，在檢測過程中可以鎖定目標離子，排除存在雜質的離子干擾，靈敏度和準確度更高。兩種方法都可用于麥角固醇和VD2的同步定量測定，在相應的線性濃度范圍內，與HPLC法相比，HPLC-MS/MS法檢測麥角固醇和VD2的線性范圍、檢出限和定量限更低，分析時間更短靈敏更高，適用于痕量物質的測定和同分異構體樣品分析，為食用菌新產品研發與質量標準完善提供理論依據與技術方法具有重要現實意義。