肺細胞外基質水凝膠治療大鼠放射性肺損傷的實驗研究*

吳鵬飛，施光清，范賢明，肖貞良，周菁

（1.西南醫科大學附屬醫院 呼吸科，四川 瀘州 646000；2.中國人民解放軍西部戰區總醫院 呼吸科，四川 成都 610083）

放射性肺損傷是腫瘤放療中常見的并發癥，目前無有效治療手段[1-2]。其發生包括早期炎癥浸潤及后期纖維化，抑制炎癥反應是治療的關鍵[3]。

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是組織再生領域的一種新型材料，是離體器官經過洗脫細胞、裂解脂膜后殘余的結構和功能蛋白復合體，含有天然的胞外微環境，對細胞的增殖、調亡及免疫等生物學行為具有調節作用[4-7]。通過凍干、酶消化等將ECM制成溫敏性水凝膠，即室溫下為液體，37℃凝固為膠凍樣，可黏附于局部組織并持續發揮作用[6]。該特性使ECM可能成為一種治療藥物，目前關于ECM水凝膠治療肺部疾病的研究報道很少。因此，本實驗通過氣管內注射肺ECM水凝膠治療大鼠放射性肺損傷研究，初步探討其可行性及有效性。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

1.1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠（成都達碩實驗動物公司）42只，6周齡，體重（220±20）g，24只用于氣管內注射肺ECM水凝膠的安全性評估，18只用于觀察肺ECM水凝膠療效，常規飼養，12 h晝夜交替。動物實驗的設計、實施過程操作符合動物倫理。

1.1.2 儀器與材料直線加速器（美國Varian公司），冷凍切片機（英國珊頓公司），倒置相差熒光顯微鏡（日本Olympus公司），冷凍干燥機（北京盛超科創生物科技有效公司），冷凍研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）。蘇木精及伊紅染液（北京索拉寶科技有限公司），生物素（美國Thermo公司），親和素（武漢博士德生物公司），大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（上海將來實業股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺ECM的制備根據SONG等[7]的肺ECM制備過程，以10%水合氯醛麻醉大鼠，12 500 u肝素+250 ml生理鹽水全身灌流肝素化，18 G針行肺動脈插管，結扎、固定，緊貼脊柱完整分離肺組織，依次予以0.1 % SDS（2 h）、純水（15 min）、1% Triton-X-100（30 min）及PBS（72 h）灌流。將所獲的肺ECM制成凍干粉劑，環氧乙烷消毒后，-80℃長期保存。

1.2.2 肺ECM水凝膠的制備將10 mg/ml肺ECM粉末混入0.1 mol/L鹽酸-胃蛋白酶液（1 mg/ml）中，室溫攪拌消化48 h，用0.1 mol/L氫氧化鈉NaOH滴定至pH 7.4，10倍PBS稀釋至1倍，經體外驗證，該水凝膠在常溫下為液態，在37℃、30 min左右可凝結成膠凍狀[8]。

1.2.3 放射性肺損傷動物模型的復制36只大鼠以10%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定于木板上，充分暴露胸部。照射野上界為兩側腋窩中點的連線、下界為劍突下緣平面，其余部位用5 cm厚鉛板遮擋，予以6MV-X線直線加速器單次照射，劑量20 Gy，劑量率3.5 Gy/min，源皮距100 cm[9]。

1.2.4 動物分組實驗一：根據氣管內注射劑量的不同（0、300、500及800μl），24只放射性肺損傷大鼠隨機分為0μl組、300μl組、500μl組及800μl組，每組6只。實驗二：18只大鼠（12只放射性肺損傷大鼠+6只正常大鼠）隨機分為照射組（照射+氣道內注射生理鹽水500μl）、ECM組（照射+氣道內注射肺ECM水凝膠500μl）及對照組，每組6只。

1.2.5 肺ECM水凝膠治療將肺ECM水凝膠與事先配好的1 mg∶180μl純水稀釋的生物素按照93∶7的濃度混勻。照射30 min后，實驗一的大鼠麻醉后固定于木板上，取仰臥位，頭抬高60°，頸部皮膚豎切口0.5 cm，逐層分離暴露氣管，環甲膜穿刺，用1 ml注射器分別緩慢注入300、500及800μl生物素標記的肺ECM水凝膠；實驗二大鼠注入500μl肺ECM水凝膠或等量生理鹽水。

1.2.6 動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）檢測在預實驗中，本課題組觀察到肺ECM水凝膠在體內約30 min成膠，因此在照射1 h后，實驗一各組大鼠麻醉后腹主動脈取血，檢測PaO2變化。

1.2.7 肺組織病理學檢測實驗二各組大鼠在照射7 d后取左肺，4%多聚甲醛固定24 h后，常規脫水、石蠟包埋及切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察肺組織病理改變。參考MIKAWA等[10]的評分方法評價肺損傷程度，包括：①肺泡充血；②肺泡水腫；③肺泡壁中性粒細胞浸潤；④肺泡壁增厚。根據損傷程度分為：無損傷0分，每高倍鏡視野下損傷范圍＜25%計1分，25%～＜50%計2分，50%～＜75%計3分，≥75%計4分，每項最高4分，總分最高16分。

1.2.8 免疫熒光染色檢測實驗一300、500及800μl組大鼠照射1 h后取左肺，OCT冷凍切片包埋劑包埋后冷凍切片，PBS清洗3次，3 min/次、5%牛血清清蛋白封閉30 min，PBS清洗3次，3 min/次、親和素反應30 min，PBS清洗3次，3 min/次，DAPI染色3 min，PBS清洗3次，3 min/次，抗熒光淬滅劑封片后觀察。

1.2.9 血清TNF-α、IL-6濃度檢測照射7 d后，實驗二各組大鼠腹主動脈取血3 ml，常溫靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取上清0.5 ml。血清TNF-α、IL-6含量檢測按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長處測定吸光度值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺ECM支架

離體肺組織顏色紅潤，脫細胞液灌流后的肺ECM，肉眼觀察肺組織大體標本變透明，HE染色未見藍染的細胞核成分，絕大多數已經洗脫肺組織有核細胞成分。見圖1。

圖1 肺ECM支架

2.2 各組大鼠PaO2比較

實驗一大鼠氣管注射肺ECM水凝膠后30 min內，800μl組大鼠死亡3只，存活率為50%，0、300及500μl組無死亡，存活率均為100%。注射30 min后，0、300、500及800μl組大鼠PaO2分別為（84.51±7.78）、（81.96±9.97）、（79.29±7.56）和（61.51±8.39）mmHg，經方差分析，差異有統計學意義（F=30.241，P=0.000）；0μl組與300μl組大鼠PaO2比較，差異無統計學意義（t=0.951，P=0.345），0μl組與500μl組大鼠PaO2比較，差異無統計學意義（t=1.947，P=0.055），300μl組與500μl組大鼠PaO2比較，差異無統計學意義（t=0.996、P=0.323），300μl組與800μl組大鼠PaO2比較，差異有統計學意義（t=7.629，P=0.000）。說明氣管注射肺ECM水凝膠300和500μl不會影響大鼠PaO2，而800μl則會影響大鼠PaO2。

2.3 各組大鼠肺泡內ECM水凝膠的分布

300、500及800μl組能在肺泡表面觀察到綠色熒光。800μl組觀察到部分水凝膠在氣道內滯留，300和500μl組未見氣道滯留，且前者比后者肺泡內綠色熒光分布更均勻、廣泛。見圖2。

2.4 各組大鼠肺組織病理學觀察及評分比較

照射7 d后通過光鏡觀察，與對照組比較，照射組大鼠肺泡間隔充血水腫、增寬，細胞浸潤增多，肺泡腔可見滲出，氣管內注射肺ECM水凝膠后，上述病理改變減輕（見圖3）。照射7 d后，對照組、照射組及ECM組的肺組織病理評分分別為（0.90±0.31）（5.50±1.95）和（3.50±0.85）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=34.282、P=0.000）；照射組與對照組肺組織病理評分比較，差異有統計學意義（t=-7.336，P=0.000），ECM組與照射組肺組織病理評分比較，差異有統計學意義（t=2.437，P=0.033）。說明氣管內注射肺ECM水凝膠能減輕放射性肺損傷早期的病理改變。

圖2 大鼠肺泡中肺ECM水凝膠的分布情況 （免疫熒光染色×400）

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平變化

對照組、照射組和ECM組大鼠血清TNF-α分別為（57.11±9.11）、（98.79±12.12）和（74.49±20.17）pg/ml，對照組、照射組和ECM組大鼠血清IL-6分別為（35.14±4.25）、（75.67±9.22）和（53.49±8.40）pg/ml，各組大鼠血清TNF-α、IL-6比較，差異有統計學意義（F=25.088和71.172，均P=0.000），照射組及ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較對照組升高（P＜0.05），ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較照射組降低（P＜0.05）。見圖4。

圖3 肺組織病理學觀察 （HE染色×200）

圖4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （n =6，±s）

3 討論

ECM材料是近年來組織再生領域研究的熱點之一，其免疫源性低，含有最天然的細胞外微環境，是種子細胞生長的理想材料[11]。同時，含有大量活性因子，體外研究表明ECM對組織細胞的行為具有多項調節作用，因此可能在組織局部發揮抗炎、免疫調節、抗纖維化及改善血管形成等多種生理作用[5，12]。近年來研究報道，將ECM制備成可注射的ECM水凝膠，局部注射后直接作用于受損組織表面，對受損腦、心肌及皮膚等有治療作用[4，12]。GHUMAN等[13]將豬膀胱ECM水凝膠注射到大鼠腦梗死區域，當水凝膠濃度為8 mg/ml時，損傷區域宿主細胞浸潤明顯，其中60%為腦源性細胞，能顯著發揮內源性修復作用。SUN等[14]發現碳納米管復合水凝膠能促進心肌細胞閏盤形成，增強其與周圍心肌細胞的黏附作用。目前，ECM水凝膠應用于肺損傷等相關疾病的研究很少。放射性肺損傷多發生在胸部腫瘤放療后或核輻射暴露后，是臨床治療的難點之一。如何減少細胞壞死，減輕炎癥反應，成為其早期治療的關鍵[3]。既往研究表明，肺組織受照射后1 h內即啟動早期炎癥反應[15]。本實驗研究提示ECM水凝膠有抗炎作用，早期給藥減輕局部炎癥反應，對放射性肺損傷產生治療作用。

本研究首先利用脫細胞方法[7]制備肺ECM支架，HE染色證實脫細胞效果滿意，然后按照WOLF等[8]和PRICE等[16]報道的方法將ECM支架制成溫敏性水凝膠。在預實驗中，將材料注射到大鼠皮下，觀察周圍炎癥反應，HE染色未見局部出血或細胞滲出增多，組織相容性好。

實驗時ECM水凝膠給藥量和給藥方式至關重要。一方面大鼠氣管直徑小，注射量過大存在窒息風險，肺ECM水凝膠在終末氣道分布過多，會影響肺組織氣體交換。另一方面，為確保給藥效果，應使水凝膠充分、均勻地附著在肺泡表面。本研究采用環甲膜穿刺、氣管內注射的精確給藥方式，結果顯示注射500μl肺ECM水凝膠后，水凝膠在肺泡表面均勻、充分分布，且不會造成大鼠死亡率上升，確定給藥方式和劑量安全有效。楊文等[17]在檢測KM小鼠氣管注射耐受量時發現，32 g左右的KM小鼠，氣管內注射生理鹽水的劑量為3.814～4.768 ml/kg時，小鼠死亡率為40%～50%，比本實驗結果稍低，可能是由于ECM凝結成膠后較生理鹽水對通氣及換氣功能的影響更大。血清TNF-α、IL-6水平在放射性肺損傷早期就顯著升高，且與局部肺組織損傷程度相關[18]。本實驗觀察到，早期氣管內注射肺ECM水凝膠抑制血清TNF-α、IL-6的表達，降低大鼠局部肺組織損傷病理評分，初步顯示ECM水凝膠局部給藥有一定的療效和研究價值。

本實驗成功獲取了肺ECM水凝膠，復制氣管內注射肺ECM水凝膠治療大鼠放射性肺損傷模型，并初步驗證其對放射性肺損傷的療效。肺ECM水凝膠對放射性肺損傷的保護作用和機制仍有待進一步研究，以明確其對肺水腫、肺組織細胞凋亡和肺部炎癥反應等的干預作用。