慢性根尖肉芽腫中TNF-α與IL-34表達的相關性*

朱永娜，陳直，宋偉，張曉東

（1.蚌埠醫學院第二附屬醫院 口腔科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 233000）

慢性根尖肉芽腫是一種以炎性骨吸收為特征的常見疾病[1]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）對該病有重要的調節作用，可調節破骨細胞分化成熟，調節骨吸收[2-4]。白介素-34（Interleukin-34，IL-34）是一種新型炎癥因子，該因子的表達受TNF-α的調節[5-6]。TNF-α和IL-34均可以調節慢性根尖肉芽腫中的骨吸收[7-8]，但慢性根尖肉芽腫中IL-34與TNF-α的關系還不清楚。因此本研究擬初步探討慢性根尖肉芽腫中兩者表達的相關性，以進一步研究TNF-α的致病機制，為后期臨床治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2018年5月就診于蚌埠醫學院第二附屬且醫院臨床及影像學診斷為慢性根尖肉芽腫的患者，收集患牙拔除時的病損軟組織13例作為實驗組。納入標準：①患者近2個月內未應用抗生素及非甾體類藥物；②患者無高血壓、糖尿病等系統性疾病，無其他口腔疾病；③患者的患牙無牙髓活力，無法保留，需要拔除；④X射線診斷患牙為慢性根尖肉芽腫；⑤患者無拔牙禁忌證。另選取本院同期就診拔除阻生牙時切除的健康牙齦組織8例作為對照組（符合納入標準中的①②⑤）。

1.2 方法

1.2.1 蘇木精-伊紅（HE）染色將收集的軟組織用去離子水沖洗3 min，置于4%的甲醛中固定24 h，石蠟包埋備用。將石蠟切成4μm厚的連續切片，然后按HE步驟進行染色。封片后，倒置顯微鏡下觀察染色結果，判定標本類型。根尖肉芽腫的病理診斷標準為：可見以大量炎癥細胞、毛細血管和成纖維細胞增生為主的炎癥肉芽組織。篩選影像學和病理診斷一致并且符合要求的標本，最終獲得實驗組9例。

1.2.2 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法將符合要求的石蠟包塊切成4μm厚切片。切片脫蠟、復水及抗原修復。用3%過氧化氫液阻斷內源性過氧化氫酶。滴加一抗50μl于4℃避光過夜孵育（IL-34抗體和TNF-α分別用抗原稀釋液1∶100和1∶500稀釋）。每張切片滴加兔抗人二抗50μl孵育20 min，加入二氨基聯苯胺顯色液在顯微鏡下觀察，至染色效果理想時終止染色。蘇木精復染3 min。切片脫水、透明，每步之間均要用磷酸鹽緩沖液充分洗滌切片。中性膠封片后在倒置顯微鏡下拍照觀察。陰性對照為肉芽腫組織，用磷酸鹽緩沖液代替一抗孵育切片作為陰性對照組。

陽性判斷標準為細胞核、細胞質或細胞膜上出現黃色或棕色顆粒。每張切片隨機選5個視野拍照，并用Image-J軟件進行分析。

1.3 影像學診斷標準

患牙根尖、根側方或根分叉處有直徑＜1 cm的低密度影像，并且邊界清晰，周圍骨質正常或者稍微變致密[9]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，相關性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組病理檢查結果比較

慢性根尖肉芽腫中見大量炎癥細胞浸潤，包括中性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞等，并伴有新生血管形成（見圖1A）。健康牙齦見大量纖維組織，炎癥細胞較少（見圖1B）。

圖1 兩組患者病理切片圖 （HE×20）

2.2 各組TNF-α、IL-34相對表達量比較

實驗組和對照組可見TNF-α表達，主要表達于細胞漿及細胞核上。實驗組和對照組TNF-α相對表達量分別為（0.246±0.059）和（0.158±0.017），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.274，P=0.002），實驗組高于對照組（見圖2）。實驗組和對照組可見IL-34表達。實驗組和對照組IL-34相對表達量分別為（0.206±0.038）和（0.131±0.023），經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=4.867，P=0.000），實驗組中IL-34表達較高（見圖3）。陰性對照組中兩者均無表達。

圖2 各組TNF-α的表達 （SP法×40）

圖3 各組IL-34的表達 （SP法×40）

2.3 IL-34和TNF-α表達的相關性

經Pearson相關檢驗，實驗組TNF-α與IL-34呈正相關（r=0.896，P=0.001），對照組TNF-α與IL-34無相關性（r=0.186，P=0.659）。

3 討論

TNF-ɑ是在病原菌、內毒素或相關物質誘導下，由單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等分泌的一種促炎因子，在骨吸收中發揮重要作用[10]。有報道在小鼠的根尖病損中發現TNF-α的表達，用藥物抑制小鼠的根尖病損后，小鼠病損組織中TNF-α的表達也受到抑制[11-12]。KIMAK等[13]在人根尖病損組織中也多次檢測到TNF-α的表達。本研究在慢性根尖肉芽腫中發現TNF-α的表達高于對照組，與之前結果一致。

本研究發現在慢性根尖肉芽腫中IL-34的表達高于對照組。2013年有學者報道牙周炎患者牙周膜細胞中IL-34的表達較高[14]。CHEMEL等[15]證實RA患者的滑膜中IL-34的表達較健康人高，本文的慢性根尖肉芽腫中IL-34表達較高，與前兩者一致。這可能因為慢性根尖肉芽腫與牙周炎及類風濕性關節炎有共同特征（均伴有炎性骨破壞）有關。破骨細胞在骨改建中負責骨吸收，核因子κB受體活化因子配體和其配體結合后能夠促進破骨細胞的增殖、分化及成熟，促進促吸收。集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF-1）與其配體結合后能夠協同核因子κB受體活化因子配體誘導破骨細胞的分化，增加其活性。IL-34和CSF-1擁有共同的配體。IL-34可以代替CSF-1協同核因子κB受體活化因子配體調節破骨細胞的分化成熟，促進骨吸收。在類風濕關節患者血清中，IL-34與核因子κB受體活化因子配體的表達呈正相關，且兩者均與骨密度水平呈負相關。可以看出IL-34主要通過核因子κB受體活化因子配體參與骨組織的破壞吸收。IL-34在慢性根尖肉芽腫中對根尖骨組織的破壞可能與核因子κB受體活化因子配體有關。

CHEMEL[15]和HWANG等[16]分別報道，在類風濕性關節炎患者的滑膜組織及滑膜成纖維細胞中存在IL-34的表達，且TNF-α可以促進IL-34的表達。RANKL在慢性根尖周炎的骨破壞中扮演重要角色，TNF-α、IL-34可通過調節核因子κB受體活化因子配體調節骨吸收。TNF-α在慢性根尖肉芽腫中除可以直接通過核因子κB受體活化因子配體調節骨破壞外，還可能通過IL-34間接調節其活性，調節炎性骨破壞[17-18]。有學者發現，TNF-α拮抗劑在臨床上能有效減輕類風濕性關節炎患者的骨組織破壞[19]。動物實驗發現，TNF-α拮抗劑可以減輕伴糖尿病小鼠的牙周炎癥[20]。本研究進一步揭示TNF-α在慢性根尖肉芽腫中的作用機制，為后期臨床應用TNF-α拮抗劑治療慢性根尖肉芽腫提供一定的理論依據。