鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度的檢查方法及效果

李雪杰 楊鐵兵 蔻友嬪

鹽酸特比萘芬凝膠為廣譜抗真菌藥物，能高度選擇性地抑制真菌麥角鯊烯環氧化酶，阻斷真菌細胞膜形成過程中的麥鯊烯環氧化反應而干擾真菌固醇的早期生物合成，從而發揮抑制和殺滅真菌作用。通過實施生物限度檢查，合理解決鹽酸特比蔡芬乳膏中抑菌成分的干擾問題，能夠準確、真實且有效反映藥物中存活污染的菌落數，而且檢出率較高。

取凝膠中的卡波姆（丙烯酸交鏈聚合物）及氯化鈣（鋇）結合形成鈣（鋇）鹽沉淀，最終保證凝膠順利通過微孔濾膜，避開沉淀物，達到破膠目的[1]。取1∶20 破膠，在經對實驗條件篩選后，供試液1 ml稀釋后過膜，同時分次取900 ml 沖洗劑進行沖洗， 使加菌回收獲得滿意果，并有效去除鹽酸特比奈芬凝膠抑真菌成分[2-3]。

1 材料與方法

1.1 材料

驗證菌的種類：大腸埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）9 8001、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽抱桿菌CMCC（B）63 501、黑曲霉CMCC（F）98003。稀釋劑及培養基的選擇：膽鹽乳糖培養基（BL）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白脈緩沖液。改良濃度為0.9%的無菌氯化鈉溶液，馬丁瓊脂培養基。

樣品：經廣西康華藥物有限公司提供的鹽酸特比奈芬凝膠。

實驗儀器的準備：選擇六聯開放式薄膜過濾器、天平、電動吸引器冰箱、高壓滅菌鍋以及培養箱、離心機等。

1.2 方法

1.2.1 制備供試液 取十四烷酸異丙酚30 ml，以及10 g 樣品，搖散、保溫。同時把保溫的pH 7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液加入其中，溫度為45 ℃，之后稀釋為100 ml，萃取并振搖。靜置分層后，取1∶10供試液的下層水相[4]。

1.2.2 制備菌液 培養18～24 h 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌的肉湯培養物于35 ℃溫度下培養，同時要制備成菌懸液，取0.9%無菌氯化鈉溶液進行制備，會有50～100 cfu 的菌落數存在于每毫升的菌懸液中，留作備用[5]。同時培養24～48 h 0.9%無菌氯化鈉溶液制備成菌懸液，在25 ℃溫度下培養，為白色念珠菌液體培養物，同時會有50～100 cfu的菌落數存在于每毫升的菌懸液中，留作備用。將0.9%的無菌氯化鈉溶液3～5 ml 加入到培養了5～7 d的黑曲霉斜面培養物中，在25 ℃的溫度下進行培養，洗掉霉菌的袍子，在制備成菌懸液時，需吸取濃度為0.9%的無菌氯化鈉溶液，會有50～100 cfu 的菌落數存在于每毫升的菌懸液中，留作備用。

1.2.3 檢驗方法 供試品對照組：需在平皿中加入等量的供試液，之后即刻將瓊脂培養基加入到平皿中，等到凝固發生之后設置出規定的溫度，細菌需培養24～48 h，霉菌及酵母菌需培養48～72 h，制備2 個平皿，并測定供試品的本底菌數，進行平行實驗[6]。（cfu 為菌落形成單位）

觀察組：需在平皿中把50～100 cfu 的試驗菌及供試液加入，之后即刻將瓊脂培養基加入到平皿中，等到有凝固發生之后培養霉菌及酵母菌48～72 h，設置規定好的溫度，細菌培養24～45 h，并實施平行培養，制備2 個平皿。

稀釋劑對照組：需選擇1 ml 的pH 為7.0 無菌氯化鈉—— 蛋白胨緩沖液，以及50～100 cfu 的試驗菌，分別進行實驗，將其注入到平皿中。觀察稀釋劑是否會干擾到試驗，另外此組各試驗菌回收率需高于70%[7]。

菌液組：需在平皿中將50～100 cfu 的試驗菌加入其中，之后需把瓊脂培養基加入到平皿中，等到有凝固發生之后培養霉菌及酵母菌48～72 h，設置規定好的溫度，細菌培養24～45 h，并實施平行培養，制備2 個平皿。

1.2.4 試驗實驗方法 培養基稀釋法：在50～100 cfu/ 皿菌液，以及平皿（0.5 ml/皿、0.2 ml/皿）中，分別取1∶10 的供試液取0.2 ml、0.5 ml 分別注入，之后各制備出2 個平行皿，即刻將15～20 ml 的瓊脂培養基加入到平皿中，當有凝固發生之后培養霉菌及酵母菌48～72 h，設置規定好的溫度，細菌培養24～45 h，并實施計數，實現對試驗菌回收率的測定。

常規法：需在平皿中分別把1 ml 的供試液及50～100 cfu 的菌液加入其中，制備出平行的皿2 個，之后需即刻將15～20 ml 的瓊脂培養基加入到平皿中，當有凝固發生之后培養霉菌及酵母菌48～72 h，設置規定好的溫度，細菌培養24～45 h，并實施計數，實現對試驗菌回收率的測定。

薄膜過濾法：需在50 ml 的稀釋劑中將1∶10 供試液10 ml 加入其中，混勻并稀釋，取薄膜過濾法沖洗、過濾，0.1%的蛋白胨溶液是主要選擇的沖洗液，同時需把50～100 cfu 的試驗菌加入到最后一次沖洗液中，細菌數在經取出已經沖洗的濾膜，貼到營養瓊脂平板上，同時要把玫瑰紅鈉瓊脂平板上貼上霉菌及酵母菌[8]。養霉菌及酵母菌48～72 h，設置規定好的溫度，細菌培養24～45 h，并實施計數，實現對試驗菌回收率的測定。

2 結果

2.1 實驗平均回收率結果

通過培養基稀釋法（0.2 ml），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%；稀釋 對照組各試驗菌回收率須＞70%；通過薄膜過濾法（沖洗量300 ml），發現黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可選擇培養基稀釋法（0.2 ml）實現細菌數計數，酵母菌及霉菌計數均選擇薄膜過濾法（沖洗量300 ml）。見表1。

表1 實驗平均回收率結果(%)

2.2 對比實驗平均回收率結果

3 批樣品5 種試驗菌回收率均＞70%。見表2。

表2 對比實驗平均回收率結果(%)

3 討論

鹽酸特比奈芬凝膠是一種新型廣譜抗真菌藥物，按照我國藥典微生物限度檢查法有關規定，在對其進行驗證中，在建立有關微生物限度檢查法時，發現鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度檢查方法的殺滅真菌作用及品種抑制均很強，尤其對于黑曲霉，具有更加顯著的作用。在檢查關于含有抑菌成分藥物的微生物限度時，要求需把供試品自身含有抑菌作用，在試驗條件下有效排除掉，被檢微生物可實施正常生長繁殖，保證不干擾染菌的限度檢驗[9-10]。細菌、酵母菌、真菌計數方法，驗證試驗菌回收率均＞70%。本研究在檢驗鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度中，實驗時分別選擇常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法3 種方法。本研究結果顯示，通過培養基稀釋法（0.2 ml），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%；稀釋對照組各試驗菌回收率須＞70%；通過薄膜過濾法（沖洗量300 ml），發現黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可選擇培養基稀釋法（0.2 ml）實現細菌數計數，酵母菌及霉菌計數均選擇薄膜過濾法（沖洗量300 ml）。經結果顯示發現，3 批樣品5 種試驗菌回收率均＞70%。同時，藥物中存活的污染的菌落數，可準確、真實地反映出來，并具有較高的檢出率。

綜上所述，在進行霉菌及酵母菌檢查中，選擇鹽酸特比奈芬凝膠薄膜過濾法，另外在進行細菌數的檢查中，選擇培養基稀釋法，得出的結果可靠，方法可行。