溶劑非溶劑法制備四逆湯微囊研究

鄒長鑫 吳鵬

摘? 要：該課題組通過溶劑-非溶劑法將四逆湯制備成具有緩釋作用的制劑，增加在胃腸道的停留時間，并考察四逆湯微囊體外表征和體外作用。通過溶劑-非溶劑法制備了四逆湯微囊，并通過單因素實驗，確定微囊最佳制備方案。考察四逆湯微囊的體外釋放。結果：最終確定囊材質量濃度為15%，囊芯與囊材的比為1：15，轉速為400r/min，乙酸乙酯與水的體積比為1：5時微囊的包封率最高，可達82.57%;體外釋放結果顯示，載藥微囊在胃液中少量釋放，而在腸溶液中可以達到緩慢釋放，最終釋放率為57.7%。該實驗采用溶劑非溶劑法制備了具有緩釋效果的四逆湯微囊。

關鍵詞：四逆湯? 微囊? 溶劑-非溶劑法? 緩控釋

中圖分類號：R94 ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號：1672-3791（2019）04（c）-0178-04

四逆湯首次在《傷寒雜病論》中被記載，其組方為炙甘草、附子和干姜，是回陽救逆的第一要藥。主要是用于四肢發冷、惡寒倦臥、大汗亡陽、脈欲絕、盆腔炎、崩漏[1]等癥。現代藥理研究發現，其具有強心[2]、調節血壓[3]、抗動脈粥樣硬化[4-5]等作用。另外，四逆湯在補足人體陽氣上有著顯著地優勢，在“火神派”的治療中，常作為“扶陽正本”的首選藥。若通常為正氣不足，脾胃虛弱的腫瘤患者服用以速效為特點的四逆湯不會完全吸收。所以，需要根據其特點制成緩控釋制劑，以便容易吸收。

市售四逆湯產品除了常見的湯劑外，還有顆粒劑和滴丸，雖用更方便，但緩釋效果不佳。微囊具有保護囊芯和長效釋放的作用，可以作為四逆湯新劑型的突破點。

四逆湯主要成分有生物堿，甘草酸，干姜的揮發油等[6]，不能靠單一的方法進行包覆，溶劑非溶劑法可將水相與有機相混合，通過改變攪拌力度等方法制備微囊。我們采用溶劑非溶劑法制備了四逆湯微囊，對其工藝進行優化，為四逆湯緩釋制劑的制備提供科學數據和理論支持。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 囊心物的提取

依照2015年版《中國藥典》四逆湯制劑規范制備。經醇沉后，冷藏靜置24h，濾過，減壓濃縮。

1.1.2 四逆湯微囊的制備

取適量的乙基纖維素（Ethyl Cellulose， EC）粉末加入乙酸乙酯溶液中，攪拌均勻，無任何塊狀物。

取適量四逆湯浸膏溶于飽和乙酸乙酯水溶液中，加入乳化劑，攪拌均勻后，用移液槍加入上述有機溶液中，溶液變為淡黃白色的乳液后繼續攪拌1h。滴加過量去離子水，EC在水溶液溶解度變小，形成微囊。繼續攪拌一小時，抽濾洗滌，干燥。

1.2 單因素考察

1.2.1 囊材濃度對包封率的影響

以乙基纖維素為囊材，囊芯與囊材的比例為1：9，乳化劑為PEG6000，乳化劑濃度為2%，有機相與水相比為1：5，轉速為400r/min。配制不同濃度的有機溶液，依照1.1.2方法制備微囊，觀察形貌并計算其包封率。

1.2.2 囊芯與囊材比對包封率的影響

按照1.1.2方法制備微囊，加入不同濃度四逆湯溶液，觀察形貌并計算包封率。

1.2.3 攪拌速度對包封率的影響

按照1.1.2方法制備微囊，考察不同轉速對微囊影響，觀察形貌并計算包封率。

1.2.4 溶劑與水的體積對包封率的影響

按照1.1.2方法制備微囊，考察有機相與水相對微囊影響，觀察形貌并計算包封率。

1.3 微囊包封率的測定

取適量微囊樣品用甲醇定容，超聲成透明溶液后，再定容，搖勻。用紫外分光光度計測微囊的包封率。包封率的計算公式：。式中：w1-微囊中甘草酸的質量（g），w2-投加料中的甘草酸的質量（g）。載藥量的計算公式：。式中：z1-微囊中甘草酸的質量（g），z2-微囊的質量（g）。

囊芯四逆湯中含有多種成分，甘草酸只是其中之一，因此分母應乘以甘草酸所占四逆湯總生藥量的百分比，實驗制得的四逆湯生藥量為0.8g/mL。

1.4 標準曲線的繪制

1.4.1 對照品溶液的配制

配制濃度為0.304mg/mL的甘草酸銨標準品溶液，密封冷藏備用。

1.4.2 最大吸收波長的確定

用紫外分光光度儀對定容10mL的標準品進行波長掃描，發現在254nm下吸光度值最大，因此確認最大吸收波長為254nm。

1.4.3 標準曲線的繪制

取不同濃度標準品定容后，在254nm下測得吸光度值。以吸光度（A）值為縱坐標，標準品濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析。回歸方程為：C=0.0767A-0.0003.R2=0.9993，n=6，c=mg/mL。甘草酸銨濃度在0～0.06mg/mL線性關系良好。

1.4.4 穩定性試驗

對照品在24h后測試吸光度，結果表明標準品在24h內穩定。

1.5 緩釋性能研究

根據《中華人民共和國藥典》2015版第二部附錄規定，該實驗采用小杯法測試微囊在人工胃液和人工腸溶液下體外釋放情況。

稱取適量四逆湯微囊和少量溶出介質置于透析袋中后，置于溫度為37±0.5℃的250mL緩釋液中，轉速為100r/min，每隔一段時間取和補充相同量緩釋液，通過紫外分光光度法檢測甘草酸銨的含量計算釋放率。

2? 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 載藥微囊的形貌表征

從圖1（a）、（b）上看載藥微囊表面平滑，多半為球狀，分散性較好，沒有粘連現象。整體反應條件溫和，在制備和干燥過程中沒有碰撞，因此得到的微囊整體形貌較好。

2.2 單因素結果

2.2.1 囊材濃度對包封率的影響

2.2.2 囊芯與囊材比對包封率的影響

2.2.3 溶劑與水的體積對包封率的影響

2.3 緩釋性能研究

從圖3看，微囊在人工腸液（pH=6.85）的前1h，釋放曲線呈急速上升趨勢，可能為在微囊淺表層的四逆湯成分，在隨后的幾小時，開始釋放緩慢，6h后釋放速率接近42.85%，24h后基本釋放完畢，整個過程的釋放速率為60.46%，表明甘草酸在人工腸溶液中有一定的緩釋作用。在人工胃液（pH=1）中，載藥微囊在前2h速率很快，在4h的累計釋放速率已經達到26.24%，之后速率下降，12h后累基本釋放完全。甘草酸在人工胃液中并不穩定，在全部釋放后會呈現降低趨勢，但整體上看載藥微囊人工胃液的釋放很少。

四逆湯對于腫瘤有一定的作用，王倩[7]研究四逆湯對于人肺腺癌細胞A549的作用，發現其能抑制Erk和激活bax通路，使A549腫瘤細胞凋亡。中醫認為[8]，腫瘤患者的體內陽氣虧損而陰氣積累成型，導致體內陰陽失調。戚瑜清[9]從《傷寒論》“典型-非典型-變化”模式下分析四逆湯，以為四逆湯應用為少陰病寒化證。所以，四逆湯能夠改善腫瘤患者體內陰陽平衡，達到培元固本，減輕化療的不適。四逆湯為速效湯劑，對于患者來說，其效過猛。為追求溫化扶陽，需要緩釋的四逆湯。

我們用溶劑非溶劑法制備四逆湯微囊;通過單因素考察，最終確定最佳工藝條件：囊材濃度為15%，芯材比為1：15，轉速為400r/min，乙酸乙酯與水的體積比為1：5;由紫外分光光度法測得微囊的包封率為82.57%，載藥量為57.7%;體外釋放實驗證明四逆湯微囊也有很好的緩釋效果。該實驗為我們課題組下一步對于中西醫結合緩釋靶向治療腫瘤做了前期材料和基礎，并為四逆湯緩釋劑型的研究提供了科學數據和理論依據。

參考文獻

[1] 林雯.四逆湯婦科病臨證治驗案報道[J].中國民族民間醫藥，2017（10）：86-87，89.

[2] 張歡歡.基于網絡藥理學的四逆湯抗心肌缺血損傷的分子機制研究[J].中國現代中藥，2018，20（3）：265-277.

[3] 李平.四逆湯聯合西藥治療陽虛型高血壓的療效及其對血壓變異性的影響[J].中國處方藥，2018，16（6）：96-97.

[4] 黃振.四逆湯對實驗性高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔SDF-1、VEGF的影響[J].湖南中醫雜志，2018，231（5）：174-176.

[5] Zhu Y， Zhao J， Han Q， et al. The Effect and Mechanism of Chinese Herbal Formula Sini Tang in Heart Failure after Myocardial Infarction in Rats[J].2018.Jun 27 ：2018.

[6] 張雯.基于有效組分的四逆湯成藥性研究[D].第二軍醫大學，2015.

[7] 王倩.四逆湯誘導肺腺癌A549細胞凋亡及對MAPK信號通路影響研究[D].南京中醫藥大學，2017.

[8] 夏克春，曾永蕾，郝皖蓉.從“陽化氣，陰成形”來探討惡性腫瘤的形成機制[J].世界中西醫結合雜志，2015（4）：573-574.

[9] 戚瑜清，李成衛，王慶國.基于“典型-非典型-變化”模式分析四逆湯類方[J].中醫雜志，2018（16）：6-8，17.