干細胞衰老分子機制的研究進展

許艷 劉如明 王諾鑫 肖建輝

遵義醫科大學附屬醫院醫藥生物技術研究所，遵義市醫藥生物技術重點實驗室（貴州遵義563003）

衰老是生命發展過程中的一個自然規律。衰老及衰老相關慢性疾病給國家和社會發展帶來沉重的負擔。研究表明，干細胞的衰老是機體衰老的根本原因；此外，衰老導致干細胞的增殖與分化能力降低，阻礙其在臨床治療中的應用。因此，探究干細胞衰老的分子機制對于延緩機體衰老及促進干細胞臨床應用十分重要。現將近年來對干細胞衰老相關信號及分子機制的研究綜述如下。

1 干細胞的衰老

干細胞具有自我更新與多向分化的潛能，是再生醫學的核心組成部分，已被應用于造血系統疾病、中樞神經系統疾病及免疫系統疾病等多種疾病的治療［1］。但是，如同體細胞一樣，干細胞也會衰老，并影響其增殖、分化及組織修復功能［2］。一方面，干細胞的衰老是機體衰老和功能障礙的重要驅動因素，與多種疾病的發生密切相關［3］，譬如在特發性肺纖維化患者中可觀察到間充質干細胞的衰老，線粒體功能下降及DNA 損傷等；此外，間充質干細胞的衰老還可能是導致骨髓增生異常綜合征轉化為白血病的重要原因［4-5］。另一方面，干細胞的衰老阻礙了其作為種子細胞在臨床治療中的應用。TURINETTO 等［6］報道，在細胞治療過程中，需要體外擴增大量的干細胞進行體內移植，然而，體外長期培養易導致間充質干細胞的衰老，喪失其修復功能。因此，研究干細胞衰老的分子機制對于解開機體衰老之謎以及促進干細胞的臨床研究有重要的意義。

干細胞衰老具有以下特征：與體細胞衰老相同的是，細胞形態變得大而扁平，衰老相關標志物β-半乳糖苷酶活性升高，細胞出現不可逆的增殖阻滯，細胞周期抑制基因表達上調［7］；而與體細胞不同的是，衰老還會影響干細胞的分化潛能，表現為成骨分化潛能下降，成脂分化潛能增強［8-9］。細胞衰老主要有兩種類型：復制性衰老和病理性衰老。復制性衰老指細胞隨著分裂次數的增加，會逐漸呈現出衰老狀態，屬于正常衰老；而病理性衰老指外界因素誘發的細胞衰老，其中外界因素主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）和輻射等［10-11］。對于干細胞的衰老機制，傳統的研究包括端粒酶活性及端粒縮短、氧化損傷、DNA 損傷、蛋白質穩態失衡以及線粒體功能障礙等［12］，多為細胞水平上的機制。隨著干細胞衰老研究的深入，近年來，干細胞衰老相關機制逐漸轉為分子水平，如Nrf2 轉錄因子、Sirtuin 家族、Wnt/β-catenin 信號通路和p53/p21 信號通路等（表1）。本文主要綜述了近年來發現的與干細胞衰老相關的信號及分子機制，以期為建立新型抗干細胞衰老的策略及促進干細胞的臨床應用提供思路。

2 干細胞衰老的分子機制

2.1 核因子E2 相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor，Nrf2）與干細胞衰老 Nrf2 是一種可以激活抗氧化基因的誘導型轉錄因子，其活性主要由Keap1 蛋白負性調節［13］。Nrf2 具有調節細胞氧化應激的作用，并以此來調控細胞內各種生理過程，包括細胞的增殖、分化以及干性維持等［14-16］。

表1 干細胞衰老相關分子及信號調節途徑Tab.1 Stem cell senescence-related molecules and signal regulation pathways

研究［17］表明，Nrf2 可以延緩氧化應激誘發的干細胞衰老，其作用主要是通過與抗氧化反應原件（在轉錄水平上調節細胞保護酶的順式作用原件）結合，上調抗氧化酶的表達水平，從而降低細胞內的ROS 含量。此外，Nrf2 還可以通過調節p53/p21 信號通路來發揮其抗氧化作用。SHIN等［18］發現，Nrf2 蛋白表達的上調可通過降低細胞周期抑制因子p53 和p21 蛋白的表達，緩解細胞增殖阻滯，從而逆轉氧化應激誘發的間充質干細胞的衰老。另有研究報道，Nrf2 可與衰老相關sirtuin 家族成員Sirt6 蛋白及RNA 聚合酶Ⅱ形成轉錄復合物，共同調節血紅素單加氧酶HO-1 的表達，延緩氧化應激誘發的骨髓間充質干細胞的衰老［19］。這些研究表明，Nrf2 在調控干細胞的衰老過程中，除了通過調節p53/p21 信號通路之外，還可與Sirt6 相互作用。目前，Nrf2 抗衰老作用的相關研究主要針對氧化應激誘發的干細胞衰老，而在復制性衰老及外界其他影響因素誘發的干細胞衰老中的作用，尚未見報道。

2.2 Sirtuin 家族與干細胞衰老 Sirtuin 家族最早在酵母中被發現，可調節細胞內多種生理過程，包括細胞凋亡、分化、糖原異生等。Sirtuin 家族成員在p53/p21、NF-κB、FoxO、PGC-1、mTOR 等衰老相關分子機制中均扮演了重要角色，其中Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt6 等家族成員與細胞衰老密切相關。

Sirt1 是一種NAD 依賴性的組蛋白去乙酰化酶，可通過對組蛋白及其他細胞因子進行去乙酰化來調節細胞衰老、代謝等生理過程。研究表明，Sirt1 具有維持干細胞功能，延緩細胞衰老的作用［20］。ZHOU 等［21］報道，在H2O2誘發的人臍帶間充質干細胞的早衰過程中，抑制Sirt1 的表達會上調p16 及p21 的表達水平，導致人臍帶間充質干細胞的早衰。此外，LIU 等［22］發現，Sirt1 可通過促進p53 蛋白的泛素化降解來增強細胞自噬能力，從而逆轉氧化應激誘發的人脂肪間充質干細胞的衰老。表明Sirt1 在不同來源的間充質干細胞的衰老中均發揮著重要作用。

Sirt2 主要參與細胞周期的調控。馬珊珊等［23］發現，Sirt2 的表達隨人臍帶間充質干細胞的衰老而下調，且過表達Sirt2 可有效抑制人臍帶間充質干細胞的衰老，促進其增殖，但具體分子機制尚不明確。

Sirt3 是第一個被發現于哺乳動物線粒體中，并與哺乳動物壽命相關的sirtuin 家族成員，具有延緩干細胞衰老的作用［24］。JUNG 等［25］報道，Sirt3 通過下調細胞線粒體內的ROS 水平來延緩間充質干細胞的衰老，且Sirt3 的表達受EphB2/c-Src 信號通路與Nrf2 基因的正向調節。

Sirt6 在DNA 修復、端粒酶功能、基因組穩定性和細胞衰老中起重要作用［26］。研究表明，Sirt6 隨骨髓間充質干細胞的衰老，表達顯著降低［27］；此外，ZHAI 等［28］研究發現，敲減Sirt6 基因可導致人骨髓間充質干細胞的衰老，使其增殖、遷移及氧化應激抵抗能力受損。這表明Sirt6 可調節干細胞的衰老過程，有助于恢復衰老干細胞的活力。

2.3 Wnt/β-catenin 信號通路與干細胞衰老 Wnt/βcatenin 信號通路是Wnt 信號通路中的經典通路，參與干細胞的增殖、凋亡等生命過程［29］。在干細胞的衰老過程中，Wnt/β-catenin 信號通路可通過調節p53/p21 信號通路、促炎因子的表達、mTOR 信號通路以及c-Myc 基因發揮作用。研究表明，在氯化鋰誘發的造血干細胞的衰老過程中，Wnt/β-catenin 信號通路的抑制可降低p53 及p21 的蛋白表達，減少ROS 的產生及DNA 損傷，從而緩解細胞衰老［30］。馬蓉潔等［31］報道，Wnt/β-catenin信號通路通過增加促炎因子的分泌來調控神經干細胞的衰老。可見，Wnt/β-catenin信號通路在不同干細胞的衰老中均起到重要調節作用。此外，另有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因c-Myc，是調控細胞周期與衰老的重要轉錄因子，其過度表達會導致腫瘤細胞的衰老［32］。因此，c-Myc 也可能在干細胞的衰老過程中起到一定的調節作用。這些研究表明，調節Wnt/β-catenin信號通路可以作為延緩干細胞衰老的潛在手段。

2.4 腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase，AMPK）與干細胞衰老 AMPK 即AMP 依賴的蛋白激酶，是生物能量代謝調節的關鍵分子。研究表明，AMPK的破壞會導致干細胞的衰老枯竭，而激活AMPK可促進衰老間充質干細胞分化為成纖維細胞，使其疤痕修復能力增強［33］。這表明了AMPK是恢復衰老干細胞年輕活力的重要靶標。

AMPK 是細胞自噬，凋亡及增殖的潛在調節因子，在干細胞的衰老過程中，AMPK 主要通過調節細胞自噬來發揮其調控作用。WHITE 等［34］報道，AMPK 通過對其下游靶標蛋白p27kip1進行磷酸化，保持細胞自噬與凋亡的平衡，從而減輕骨骼肌干細胞的衰老。BORODKINA 等［35］發現，AMPK 的活性受細胞內Ca2+離子的負調控，Ca2+離子水平降低會引起線粒體內能量失衡，從而激活AMPK，使其磷酸化，促進細胞自噬來防止人子宮內膜來源干細胞的早衰。此外，AMPK 還被細胞內Alpl 基因調控，Alpl 基因的缺失會導致AMPK 失活，進而上調骨髓間充質干細胞p16 以及p53 的表達水平，導致細胞衰老及衰老相關疾病的發生［36］。可見，AMPK 在細胞內受多種因素的調控，且在不同干細胞的衰老過程中，激活AMPK 均能起到延緩細胞衰老的作用。

2.5 p53/p21 信號通路與干細胞衰老 p53/p21 信號通路也參與了細胞衰老過程的調節。研究表明，敲減腫瘤抑制因子p53 后，可下調p21 的表達，抑制細胞自噬，減輕間充質基質細胞的衰老［37］。但p21 基因不是p53 誘發細胞衰老的唯一途徑，KIM 等［38］發現在成纖維細胞中，p53 可以同時調節p21 蛋白和蛋白激酶B，而P21 和蛋白激酶B 分別調控細胞周期及ROS 水平，從而誘發細胞衰老。

調控p53/p21 信號通路是延緩干細胞衰老的有效方法。研究表明，膽固醇及氫氣均通過減少細胞內ROS 的積累，下調p53 和p21 蛋白的表達，從而逆轉細胞增殖阻滯，延緩骨髓間充質干細胞的衰老［39-40］。在干細胞的衰老過程中，p53/p21 信號通路也受多種信號通路調節。上文已提到Nrf2、Sirt1、AMPK 及Wnt/β-catanin 信號通路皆可通過調節p53/p21 信號通路來調控干細胞的衰老。此外，NFκB 信號的激活也會上調p53 和p21 蛋白的表達水平，導致人牙髓干細胞的衰老［41］。因此，在干細胞衰老的信號分子調控過程中，p53/p21 信號通路是各調節途徑潛在交互作用的重要節點。

2.6 其他信號分子與干細胞衰老 Nanog 蛋白因具有調節細胞周期、DNA 復制與DNA 損傷修復的作用，也在細胞衰老過程中扮演了重要角色。研究表明，Nanog 蛋白通過下調p27 蛋白（控制細胞從G1 期進入S 期的細胞周期依賴性蛋白酶抑制因子）的表達，抑制小鼠成纖維細胞的衰老［42］。SHAHINI 等［43］發現，Nanog 可逆轉間充質干細胞的衰老，恢復其肌源性分化潛能。

MicroRNAs 是一種小的非編碼RNA 片段，其可通過調節p53/p21 或pRB/p16 信號途徑來調控細胞衰老過程，因此，microRNAs 被認為是衰老的關鍵調節劑［44］。目前已報道多個microRNA 具有調節干細胞衰老的作用，如miR-27b、miR-195 及miR-495，但它們在干細胞中調控衰老的方式均有不同。miR-27b 通過上調衰老間充質干細胞內p16及MAPK3 的表達，促進間充質干細胞的衰老［44］。miR-195則通過抑制端粒酶的活性，導致間充質干細胞的衰老，使其增殖與分化潛能喪失［45］。miR-495 被報道也參與了間充質干細胞衰老的調節，其主要通過抑制細胞周期及促進細胞凋亡來誘發間充質干細胞的衰老［46］。這些研究表明了microRNAs 在干細胞的衰老中主要起促進作用。

此外，Notch 信號通路的激活可降低p16 及p21 蛋白的表達，促進細胞的增殖與分化，防止間充質干細胞在長期培養過程中出現老化［47］。JIN 等［48］報道，在缺氧培養環境中，多梳抑制復合物BMI1 可通過下調MKP-1 表達，激活p38 MAP 激酶，使環氧合酶-2 的表達上調，并刺激前列腺素PGE2 的生成，從而增強人臍帶間充質干細胞的增殖能力，緩解衰老狀態。YANG 等［49］發現在D-半乳糖誘導的間充質干細胞的衰老中，激活AKT/mTOR 通路可減少細胞內ROS 的積累，抑制間充質干細胞的衰老。

3 結語與展望

現代社會，人口老齡化日益加重，由衰老引發的相關疾病極大的降低了人們的生存質量，造成了社會經濟負擔急劇增長，已成為影響社會發展的嚴重問題。因此，延緩衰老成為人們關注的熱點問題。機體干細胞能夠維持體細胞的不斷更新，其衰老枯竭可能是生命體衰老的根本原因。因此，延緩干細胞的衰老是抗衰老研究的重要突破口。盡管目前對干細胞衰老的認識已取得一定進展，發現并闡明多個信號分子及多條信號途徑與干細胞的衰老密切相關（表1），但仍然存在以下一些問題亟待解決：（1）是否存在新的衰老信號分子或信號通路？（2）干細胞衰老往往涉及多種信號通路，如何闡明各信號通路間的交互作用？（3）干細胞衰老和機體衰老間的精密作用機制到底如何？（4）不同干細胞衰老的機制不盡相同，造成這種差異的根本原因是什么？但筆者相信，隨著干細胞衰老研究的不斷深入和抗衰老策略的持續開發，加快干細胞的臨床應用以及實現延緩人類衰老的目標正漸行漸近。