中波紫外線誘導HaCaT細胞自噬的研究

王超鵬 蔣麗君 陳富強 周美娟

南方醫科大學公共衛生學院放射醫學系，廣東省熱帶病研究重點實驗室（廣州510515）

日光中的紫外線，尤其是中波紫外線（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人體表皮細胞損傷最常見的環境因素之一。占表皮細胞90%的角質形成細胞是皮膚表皮的重要組成部分，同時也是UVB的主要靶細胞［1］。UVB 可通過氧化應激，DNA 損傷等引起輻射損傷［2-3］，甚至誘發皮膚癌［4］。

自噬，又稱“自食”，是機體細胞在生長因子或營養素缺乏、缺氧、內質網應激等有害刺激下所發生的自穩過程，是真核生物中進化保守的對細胞內的物質進行轉運、降解和重新利用的過程［5］。生理情況下，細胞自噬性降解可維持機體的穩態，但外界因素誘導的自噬失調可能與腫瘤、感染、神經退行性病變等疾病相關。既往研究中，UVB 對皮膚細胞的凋亡誘導效應研究較為透徹，但UVB對皮膚細胞自噬的誘導研究較少。因此，闡明UVB 和自噬在皮膚慢性損傷中的作用及其機制尤為重要。本研究以HaCaT 細胞為研究對象，基于預實驗結果，采用半數紅斑劑量，即30 mJ/cm2UVB 照射為處理因素，深入探討UVB 對HaCaT 細胞自噬的誘導效應及自噬與凋亡的相互作用關系，以期為UVB 的輻射損傷治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.2 細胞培養與傳代 HaCaT 細胞培養在含體積分數為10%的胎牛血清、1 × 105U/L 的青霉素、100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養基中，于37 ℃、5%的CO2培養箱中常規培養。待細胞長至80%～90%時，PBS 洗滌兩次后加入0.25%胰酶消化，待細胞變圓后加入DMEM 終止消化，1 200 r/min 離心5 min，離心收集細胞，傳代后進行后續實驗。

1.3 細胞處理

1.3.1 紫外照射取對數生長期的HaCaT 細胞 用PBS 洗滌兩次，加入一定量的PBS（其中6 cm 皿：1.9 mL；96 孔板：28 μL），置于距UVB 光源垂直距離40 cm 的紫外光源箱體指定位置，功率密度為165 μW/cm2，照射相應時間。照射結束后吸棄PBS，加入完全培養基，繼續培養至相應時間點進行后續實驗。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞增殖 取對數生長期的HaCaT 細胞按每孔5 × 103個細胞接種于96 孔板，常規培養24 h 后，接受UVB 處理，對應時間點加入10 μL/孔CCK-8 溶液，37 ℃恒溫孵育2 h 后，酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度。實驗重復3 次。

1.3.3 透射電鏡檢測自噬小體 30 mJ/cm2UVB 處理24 h 后收集貼壁細胞。PBS 洗滌3 次后，將細胞刮下，1 200 r/min 離心5 min，吸棄上清后加入4%戊二醛固定過夜，經漂洗、脫水、浸透、包埋，超薄切片后進行透射電鏡觀察并拍照。

1.3.4 MDC 染色標記自噬小體囊泡 30 mJ/cm2UVB 處理24 h 后，PBS 洗滌細胞2 次，加入0.05 mmol/L 的MDC 染料，37 ℃避光孵育30 min，PBS 緩沖液漂洗兩次，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。每孔至少選取3 個視野，實驗重復3 次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測 30 mJ/cm2UVB處理24 h后收集細胞。100 μL 預冷的1×Annexin V binding buffer 重懸細胞后，分別加入5 μL Annexin V FITC 和5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×Annexin V binding buffer 混勻后上機檢測。

1.3.6 Western Blot 檢測自噬和凋亡相關蛋白表達 HaCaT 細胞長至70%～80%融合度時，接受UVB 照射。分別在照射后6、12、24、36、48 h 收集細胞，提取細胞總蛋白。經煮沸變性后行SDSPAGE 凝膠電泳，并轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次后，加入相應二抗室溫孵育2 h，ECL 發光試劑盒檢測發光強度。

注意不要遺漏三防門門洞四角部45°的構造筋。內外側每角放置1Φ 16 mm，L=1 000 mm的斜向鋼筋。當墻厚D≤400 mm時，每角2Φ 16 mm；D﹥400 mm時，每角3Φ 16 mm。

1.4 統計學方法 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件分析處理。計量資料以均數±標準差表示。采用單因素方差分析進行組間比較，兩兩比較采用SNK 法，方差不齊時使用Games-Howell 法校正。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UVB 能夠誘導HaCaT 細胞自噬

2.1.1 透射電鏡觀察自噬小體 30 mJ/cm2UVB 照射24 h 后，HaCaT 細胞內可見雙層膜結構的自噬小體，內含大量細胞器和折疊蛋白（圖1）。

圖1 透射電鏡觀察30 mJ/cm2 UVB 照射后HaCaT 細胞內自噬小體的情況Fig.1 The changes of autophagosomes in HaCaT cells under TEM

2.1.2 MDC 染色觀察細胞自噬小體囊泡 與對照組相比，30 mJ/cm2UVB 照射HaCaT 細胞24 h后，MDC 染色可見HaCaT 細胞中的酸性自噬囊泡明顯增多，熒光強度加強，說明UVB 能夠誘導Ha-CaT 細胞自噬（圖2）。

圖2 MDC 染色檢測細胞自噬Fig.2 Detection of autophagy by MDC staining

2.1.3 Western Blot 檢測自噬相關蛋白表達Western Blot 結果顯示，30 mJ/cm2UVB 照射后，LC3-Ⅱ、Beclin-1 以及SQSTM1 的蛋白表達水平顯著升高，其中LC3-Ⅱ、SQSTM1 在照后24 h 達到最高點，48 h 表達量下降，Beclin-1 在照后48 h 依然維持在較高水平（圖3）。

2.2 UVB 誘導了HaCaT 細胞保護性自噬

2.2.1 運用3-MA抑制自噬后，增加了UVB誘導的HaCaT 細胞凋亡 3-MA 是一種經典的Ⅲ型PI3K抑制劑，作用于Vps34 和PI3Kγ，會阻斷自噬體的形成［6］。運用3-MA 抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表達下降（圖4C），自噬水平降低，UVB 對HaCaT細胞的凋亡誘導作用增加（P＜0.05，圖4A），細胞增殖減慢（P＜0.05，圖4B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達增加（圖4C）。

圖3 Western Blot 檢測自噬相關蛋白的表達Fig.3 Detection of autophagy-related Protein markers by Western Blot

圖4 運用3-MA 抑制自噬對細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Inhibition of autophagy by 3-MA on cell proliferation and apoptosis

2.2.2 運用siATG5 抑制自噬后增加了UVB 誘導的HaCaT 細胞凋亡 自噬相關基因ATG5 在自噬小體的形成中發揮至關重要的作用，它與ATG12共同形成ATG5-ATG12 復合物，幫助自噬體膜伸展擴張［7］。運用ATG5 小干擾RNA（siATG5）抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表達下降（圖5C），自噬水平降低，UVB 對HaCaT 細胞的凋亡誘導作用增加（P＜0.05，圖5A），細胞增殖減慢（P＜0.05，圖5B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達增加（圖5C）。

圖5 運用siATG5 抑制自噬對細胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Inhibition of autophagy by siATG5 on cell proliferation and apoptosis

2.3 UVB通過AMPK/mTOR信號通路誘導HaCaT細胞自噬 30 mJ/cm2UVB 處理HaCaT 細胞24 h后，用Western Blot 檢測AMPK/mTOR 信號通路節點蛋白的表達水平見圖6。UVB 照射后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達增加，p-mTOR蛋白表達降低，而總mTOR 和ULK1 蛋白表達沒有明顯變化。運用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平下降，p-mTOR 蛋白表達增加。

3 討論

UVB 是皮膚癌的主要原因之一［8］，其對皮膚的損傷作用被廣泛報道。研究發現UVB 能夠通過誘導細胞DNA 損傷、死亡受體激活、活性氧簇（ROS）等方式導致細胞死亡［9-10］。凋亡與自噬是細胞中存在的兩種程序性死亡方式，是正常的生理和病理的關鍵［11］。凋亡，又稱為Ⅰ型程序性死亡，在維持內環境穩定的過程中發揮重要作用。自噬，又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是機體細胞面對營養因子缺乏、細胞器功能障礙及病原體入侵時的自穩過程。目前通常認為兩者呈如下關系：（1）細胞通過誘導自噬抑制或推遲細胞凋亡的發生，促進細胞的存活；（2）細胞自噬通過誘導凋亡基因的活化，加速凋亡進程，促進細胞死亡；（3）二者雖有共同的上游通路，但功能獨立，共同維持細胞內環境的穩定。既往研究中，CAVINATO 等［12］研究發現，自噬在UVB 誘導的皮膚成纖維細胞（HDF）衰老的早期階段被激活，阻斷細胞內ROS的積累可抑制UVB 誘導的自噬。而CHEN 等［13］研究發現UVB 通過雷帕霉素（mTOR）非依賴性途徑下調ULK1 和ATG7 的表達，抑制表皮HEKs 細胞的自噬。筆者前期研究發現，UVB 能夠通過caspase-3、PARP 等凋亡通路誘導HaCaT 細胞發生凋亡，并呈現劑量和時間依賴關系。但UVB 對Ha-CaT 細胞自噬的誘導效應及其通路研究卻未闡明，因此，本研究就UVB 對HaCaT 自噬的誘導效應及其與凋亡的關系展開具體研究。

圖6 Western Blot 檢測AMPK/mTOR 通路關鍵蛋白的表達Fig.6 Detection of key proteins in AMPK/mTOR pathway by Western Blot

透射電鏡可以直觀的檢測細胞內的自噬小體及自噬溶酶體的結構形態和數量［14］。LC3-Ⅱ、Beclin-1、SQSTM1 是細胞自噬的標志蛋白，也是目前公認的自噬檢測生物標志物。其中，Beclin-1 在自噬起始時發揮重要作用，是形成自噬體的必需分子之一。LC3B-Ⅱ則分布于自噬體內膜和外膜上，其蛋白表達量可反映細胞自噬活性的強弱。SQSTM1，是一組由SQSTM1 基因編碼的泛素結合蛋白，通過與LC3-Ⅱ的C 端的LIR 結構域結合，共同參與自噬體與溶酶體的融合及降解［15］。

本研究采用半數紅斑劑量UVB（30 mJ/cm2）照射HaCaT 細胞，結果顯示：30 mJ/cm2UVB 照射后，HaCaT 細胞內可見雙層膜結構的自噬小體，內含大量細胞器和折疊蛋白。LC3B-Ⅱ、Beclin-1 和SQSTM1 的表達均增加，呈一定時間依賴關系。其中，LC3-Ⅱ和SQSTM1 在照后24 h 達到最高點，36 h 表達開始下降。Beclin-1 在照后48 h 依然維持在較高水平。綜合分析，UVB 照射誘導HaCaT細胞發生了自噬。為了進一步驗證UVB 誘導的自噬對HaCaT 細胞生存的影響，本研究采用3-MA 和ATG5 小干擾RNA（siATG5）抑制UVB 誘導的自噬，觀察自噬在HaCaT 細胞生存中發揮的作用。研究發現，利用自噬工具藥3-MA 和siATG5 抑制自噬后，UVB 誘導的HaCaT 細胞凋亡增加，細胞增殖減慢，凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達增加，這表明UVB誘導的自噬在HaCaT 細胞生存中發揮保護性作用。

既往研究［16］表明，AMPK/mTOR 通路在細胞自噬的調控中發揮重要作用。在對自噬的調控中，AMPK 和mTOR 既相互獨立，又具有上下游的關系。一方面，AMPK 可直接激活ULK1-Atg13-FIP200 復合體，促進Beclin-1 蛋白的表達，誘導自噬發生；另一方面，AMPK 還可直接抑制mTOR 復合體1（mTOR complex 1，mTORC1）的活性，促進自噬發生［17］。本研究中，UVB 照射引起AMPK、p-ULK1 蛋白表達增加，p-mTOR 蛋白表達量下降。運用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，與單獨照射組相比，AMPK、p-ULK1 蛋白表達量下降，p-mTOR 蛋白表達量增加，這表明UVB 照射也是通過AMPK/mTOR 通路誘導自噬發生，其可能的機制為：UVB照射誘導AMPK 表達增加，AMPK 表達增加抑制mTOR 蛋白的磷酸化，促進ULK1 的磷酸化和Beclin-1 的表達增加，促進HaCaT 細胞發生自噬。

綜上所述，UVB 能通過AMPK/mTOR 信號通路誘導HaCaT 細胞發生自噬，該自噬對HaCaT 細胞呈保護作用。有關其他自噬信號通路是否參與了UVB 誘導的皮膚細胞自噬，筆者將在后續工作中開展相關研究。