鼻咽癌患者外周血中循環miR-31-5p表達及臨床意義

易世江 熊偉明 栗子芳 凌月福 何曉松 劉鵬

1桂林醫學院附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科（廣西桂林541001）；2廣西壯族自治區人民醫院耳鼻咽喉-頭頸外科（南寧530021）

鼻咽癌是我國南方地區一種常見的頭頸部惡性腫瘤，病例類型以非角化性癌為主，放射治療是其主要的治療方法。雖然隨著放療技術的不斷進步，鼻咽癌的5年生存率較前明顯提高，但是仍有30%的患者出現局部復發及遠處轉移，也是導致治療失敗的主要原因。其中放療抵抗是復發的主要因素［1-2］。microRNAs（miRNAs）是一類長約22 核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，通過與目標基因的3′UTR 結合，在轉錄后水平調節基因表達［3］。miRNAs 是多種細胞生理過程的關鍵調控因子，包括增殖、分化、凋亡、存活、運動和形態發生。異常表達的miRNAs 存在于不同類型的腫瘤，參與腫瘤的發生發展與放化療抵抗。在口腔、鼻咽部、喉部、唾液腺等解剖亞區頭頸腫瘤中，miRNAs被認為是腫瘤分子標志物。而miR-31-5p 是眾多miRNAs 分子中的一員，異常表達見于多種惡性腫瘤［4-5］。鼻咽癌中研究發現miR-31-5p 存在異常低表達，其低表達可以促進鼻咽癌的惡性生物學行為［6］。但有關外周血miR-31-5p 在鼻咽癌中的研究尚未見報道，因此本研究擬通過檢測外周血中循環miR-31-5p 的表達，分析其在鼻咽癌患者與健康人中的表達有無差異，探討miR-31-5p 與鼻咽癌患者臨床病理參數和放療的關系，為miR-31-5p 可能作為鼻咽癌新的腫瘤標志物及治療靶點提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年2月至2016年10月桂林醫學院附屬醫院收治的55 例鼻咽癌患者外周全血為觀察組，男35 例，女20 例，年齡29～70 歲，平均（49.2 ± 10.8）歲；所有患者均為初治且經病理診斷明確，病理組織類型為未分化型非角化性癌，腫瘤TNM 分期標準采用AJCC 第7 版分期。另選取我院體檢中心55 例經臨床診斷無腫瘤相關疾病的健康體檢者外周全血為正常對照組，男31 例，女24 例，年齡35～69 歲，平均（45.3 ±9.5）歲。本項研究通過我院倫理委員會批準，并同時簽署患者知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 合成 所有患者均采集靜脈EDTA 抗凝血5 mL，對全血總RNA 提取采用TRI REAGENT BD（MRC GENE）試劑進行抽提。使用NanoDrop?ND-1000 測定RNA 濃度和純度，OD260/280 值在1.8～2.1 之間為合格樣品，經檢測所有實驗樣品均合格。然后合成cDNA，首先備RT 混合反應液：2.5 mmol/L dNTP 混合液（dATP、dGTP、dCTP 和dTTP 各2.5 mmol/L）2 μL，10×RT 緩沖 液（250 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，200 mmol/L KCl，40 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT）2 μL，RT 特異引物（1 μmol/L）1 μL，Total RNA 200 ng，MMLV反轉錄酶（10 U/μL）2 μL，RNA 酶抑制劑（40 U/μL）0.3 μL，用無RNA 酶水將反應總體積補充至20 μL；然后在PCR擴增儀進行RT反應，16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育42 min，85 ℃孵育5 min，反應結束后立即將產物取出，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 實時熒光定量PCR 反應按照以下說明進行操作。將所有cDNA 樣品分別配置Realtime PCR 反應體系，體系配置如下：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L PCR 特異引物F 0.5 μL，10 μmol/L 的PCR 特異引物R 0.5 μL，加水至總體積為8 μL，輕彈管底將溶液混合，5 000 r/min 短暫離心；將8 μL 混合液加到384-PCR 板對應的每個孔中，再加入對應的2 μL cDNA。粘上封口膜，并短暫離心混合，將上述384-PCR 板置于Realtime PCR 儀上進行PCR 反應，每個樣品設置3 個復孔，反應條件為：先預變性95 ℃，10 min；然后變性95 ℃，10 s；退火/延伸60 ℃，1 min，共擴增40 個循環；為了建立PCR 產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。以U6 為內參對照，根據qPCR 曲線得到循環數CT 值，miR-31-5p 的相對表達量用2-△△CT表示。以上所有步驟按照上海康成生物公司的相關操作說明進行，PCR 引物由上海英駿生物公司合成，引物序列：U6 F：5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，R：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′。miR-31-5p SP：5′GGAGGCAAGATGCTGGC3′，R：5′GTGCGTGTCGTGGAGTCG3′。

1.3 分組標準 同期放化療結束后3 個月內無局部殘留或1年內無復發定義為放療敏感組，而放療后3 個月內有局部殘留或1年內復發定義為放療抵抗組，即將患者分為放療抵抗和放療敏感兩組［7］。

1.4 統計學方法 運用SPSS 13.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（x ± s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌患者與健康對照組外周血中miR-31-5p 的表達 各組提取的總RNA 純度均符合實驗要求，經溶解曲線發現為單一峰，跑膠驗證為目的條帶。檢測鼻咽癌患者外周血miR-31-5p 相對表達量為（0.658±0.217），明顯低于正常對照組的相對表達量（0.976 ± 0.242），差異具有統計學意義（t=-7.216，P＜0.001）。

2.2 miR-31-5p 表達與臨床病理特征的相關性分析不同病理分期的鼻咽癌患者外周血中miR-31-5p 的表達水平，發現miR-31-5p 的表達水平與腫瘤的T 分期、局部有無淋巴結轉移關系密切（P＜0.05）。但是，與鼻咽癌患者的年齡、性別、是否遠處轉移不具有相關性（P＞0.05）。見表1。

2.3 miR-31-5p 表達水平與放療 隨訪1年后，將55 例患者按標準納入分組。其中，鼻咽癌放療抵抗患者17 例（30.9%），鼻咽癌放療敏感患者38 例（69.1%）。外周血miR-31-5p 相對表達水平分別為（0.529 ± 0.146）和（0.685 ± 0.245），兩組比較差異具有統計學意義（t=-2.906，P=0.006）。

3 討論

miRNAs 是一類保守、長約18～22 nt 的非編碼RNA 分子，可作為腫瘤抑制因子或癌基因在轉錄后水平調節基因表達。研究［8-9］顯示miRNAs 調控人類基因組中超過30%的基因表達，此類基因與細胞增殖、分化、代謝以及器官形成相關。異常表達的miRNAs 存在于不同類型的腫瘤組織及細胞系中，參與腫瘤的發生發展［10］。

表1 鼻咽患者miR-31-5p 的表達與臨床參數的關系Tab.1 Association between miR-31-5p expression and clinicopathological features in NPC patients x±s

越來越多研究發現miRNAs 可作為腫瘤早期診斷及預后評估的潛在分子標志物［11］。但是這些研究主要是基于活檢組織，具有一定的局限性，因為并不是所有部位的腫瘤都能獲得足夠的組織樣本去病理分析，尤其是早期腫瘤［12］。近幾年研究顯示血清miRNAs 可作為直腸癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤診斷和預后的分子標記物，相對于組織內檢測，其具有無創、簡便、易于操作的優點［13］，因此循環miRNAs 有望作為一種腫瘤標志物用于指導癌癥的診斷和治療，為腫瘤的監控及預測復發提供了一種新途徑。

miR-31-5p 在直腸癌、肺癌等中過表達，而在胃癌、前列癌、乳腺癌等低表達［14］。ZHAO 等［15］研究表明，與正常肝細胞肝癌細胞系相比，miR-31-5p在肝細胞癌（HCC）細胞系中下調。并且miR-31-5p 過表達可靶向結合并抑制特異性蛋白1（SP1），誘導HCC 細胞生長、遷移、侵襲和細胞周期阻滯。ITO 等［16］報道miRNA-31-5p 可 能 調節BRAF 的 活化，并在結直腸癌EGFR 下游的信號通路中發揮作用。進一步研究顯示，在鼻咽癌組織及細胞系中檢測發現存在miR-31-5p 的低表達，miR-31-5p 是鼻咽癌重要的腫瘤抑制miRNA。miR-31-5p 可通過直接調控缺氧誘導因子1（FIH1）和微小體維持蛋白2（MCM2）降低鼻咽癌細胞生長［17］。另外，WU 等［18］首次使用非病毒小圓環載體（a non-viral minicircle vector）靶向結合miR-31-5p 影響其表達，證明了minicircle-orip-miR-31 可以作為一種新治療鼻咽癌的靶向miRNA。這些數據進一步闡明了miR-31-5p 可能是一個很有前景的綜合研究候選基因，也是未來基因治療的可能位點。但外周血中表達的情況尚未報道。筆者發現，鼻咽患者外周血中miR-31-5p 的表達水平與正常健康人存在明顯差異，并隨腫瘤分期的進展表達水平隨之下降。這說明miR-31-5p 在鼻咽癌中扮演抑癌基因的角色。因此外周血中miR-31-5p 可能成為鼻咽癌早期診斷的一個潛在標記物。但是本組研究中miR-31-5p 的表達水平與腫瘤是否發生遠處轉移無關，這種結果的出現考慮與樣本量較小有關。

近十年來，miRNAs 在放療抵抗中的調控作用和機制一直是腫瘤研究的熱點。miRNAs 的表達受輻射調控，而改變后的miRNAs 通過多種細胞信號通路和多種生物過程改變腫瘤對放射的敏感性［19］。放療抵抗是鼻咽癌治療失敗一個主要原因，而miRNAs 與鼻咽癌的放療抵抗有密切關系［20-21］。有研究［22］顯示miR-31-5p 在放療抗性的食道癌細胞中存在低表達，而重新再表達后可以明顯恢復腫瘤細胞對放療的敏感性。另一項有關直腸癌動物模型的研究［23］發現，抑制miR-31-5p 的表達可以提高腫瘤細胞對放療的抵抗，其作用機制與調節hMLH1 的水平有關。上述研究說明miR-31-5p 低表達可以引起放療抵抗作用。本研究發現，在放療1年后復發的鼻咽癌患者中，miR-31-5p 的表達水平亦低于未復發的患者，這也提示miR-31-5p 的低表達可能導致放療抵抗，從而降低鼻咽癌對放療的敏感度，這與上述研究的觀點一致。

當然，本研究僅是對外周血miR-31-5p 的初步研究，仍存在一些不足之處。如：樣本量不夠大；鼻部炎性病變或者癌前病變的患者未納入研究；未對比同一患者外周血與活檢組織中miR-31-5p表達水平的差別；放療過程中、放療結束后未監測miR-31-5p 動態表達水平的變化；未就miR-31-5p表達水平的高低與生存時間的長短進行分析。但是，本研究發現鼻咽癌患者外周血miR-31-5p 的表達水平較健康人明顯降低，并與腫瘤的分期以及放療效果相關，將可能作為鼻咽癌早期診斷及預后評估的分子標志物。目前miR-31-5p 在鼻咽癌中發揮的分子機制尚不清楚，因此課題組下一步將探討miR-31-5p 對鼻咽癌細胞的生物學影響，闡明其下游分子作用機制，為深入理解鼻咽癌的發病機制和尋找靶向藥物奠定理論基礎。