糖皮質激素治療對系統性紅斑狼瘡患者外周單個核細胞TLR7和TLR9表達的影響及相關因素分析

許敏玲 陳桃 蔡琪

南方醫科大學附屬小欖醫院風濕免疫科（廣東中山528415）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統、多器官的自身免疫性疾病。發病機制涉及遺傳、環境和感染等多種因素，其特征包括B 細胞的過度活躍，自身抗體產生，以及對自身抗原的耐受性喪失，最終形成沉積在組織中并誘導炎癥的免疫復合物［1］。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類進化上高度保守的模式識別受體，可識別不同的病原體相關分子模式，通過多種信號傳遞途徑調節免疫系統功能。最近越來越多的研究［2-5］表明，TLRs 可能參與SLE 的發病機制，在B 細胞的激活和免疫復合物形成等過程起重要作用。迄今，人類TLR 家族成員現已確認的有12 個（TLR 1～12）。其中TLR7 和TLR9 被認為與SLE 的發病最為密切［6］。TLR7 和TLR9 可通過識別含DNA 或RNA 內源性的抗原，誘導產生自身免疫應答，或參與樹突細胞和B 細胞的活化。既往研究［6-10］顯示SLE 患者的疾病活動與多種TLRs（包括TLR2，TLR4，TLR7，TLR9 等）的表達水平相關。然而，SLE 的臨床表征和實驗室指標與TLRs 的相關性仍不明確，受不同種族、檢測條件、實驗設計的影響存在較大的差異。此外，糖皮質激素是治療SLE 的主要藥物，用于減輕炎癥反應和抑制免疫系統的活動性。糖皮質激素可能直接或間接對免疫細胞的TLRs 激活機制產生影響［11］，從而影響SLE 患者中TLR7 和TLR9 的表達。因此，本研究將探明SLE 患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）TLR7 和TLR9 的表達水平與臨床表征的相關性，并重點分析糖皮質激素抗炎治療對TLR7 和TLR9表達的影響，了解TLRs 介導的免疫調節與糖皮質激素治療之間的聯系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象為2016年11月至2017年12月間南方醫科大學附屬小欖醫院門診和住院收治的SLE 患者40 例。所有病例符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE 標準。其中包括初次診斷并未行糖皮質激素治療的SLE 患者16 例（初次診斷組），以及在過去1 個月中糖皮質激素維持治療的患者24 例（激素治療組，激素治療期≥1 個月）。另選取19 例健康體檢者抗凝外周靜脈血標本作為健康對照組，均排除SLE、其他自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病，其中女17 例，男2 例，采用年齡段、性別匹配。研究對象全部知情同意并簽署知情同意書，醫院倫理委員會同意開展此項研究。

1.2 臨床數據收集及研究變量定義 從病歷收集的信息包括患者人口學特征（年齡、性別），以及SLE 相關的臨床表現：盤狀皮損、蝶形紅斑、光敏等，實驗室檢查包括血細胞分析、自身抗體包括抗核抗體、抗ds-DNA 抗體、抗Sm 抗體以及血沉、C-反應蛋白、補體C3 和C4。患者均進行了常規臨床癥狀調查、檢測指標的測定，并根據系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（disease activity index for lupus patients，SLEDAI）進行評分。合并皮膚損害定義為至少有一項皮膚病變指標（包括盤狀皮損、蝶形紅斑、光敏）；合并腎臟損害定義為至少有一項異常檢測指標（包括血肌酐、血尿素、血尿酸和尿蛋白）。糖皮質激素日均劑量為過去1 個月的平均日劑量（用等效強的松換算）。糖皮質激素治療期為不間斷的糖皮質激素治療時間總和。

1.3 外周血淋巴細胞的分離和RNA 提取 抽取SLE 患者和正常人外周血6 mL，EDTA 抗凝，采用Ficoll 密度梯度離心法淋巴細胞分離液（達科為公司）分離PBMC，-80 ℃保存備用。細胞總RNA 的提取參照Qiagen RNA mini kit 提取說明書進行。抽提的總RNA 以DNaseⅠ消化，再以氯仿-異丙醇提取，得到的RNA 以DEPC 水溶解。用紫外分光光度計測定RNA 濃度及純度，用凝膠電泳法檢測RNA 的完整性。

1.4 TLR7 和TLR9 基因表達的檢測 將提取總RNA 使用反轉錄試劑盒（日本Takara 公司）進行反轉錄。取1 μL 提取的RNA 以OligodT 進行逆轉錄。反應條件為：42 ℃60 min，75 ℃15 min，反轉錄生成的cDNA 于-80 ℃保存備用。使用SYBR 試劑（日本Takara 公司）進行實時定量PCR 反應，采用7500 Real-time PCR System（美國ABI 公司）檢測TLR7 和TLR9 基因的轉錄水平，以β-actin 為內參照。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。TLR7：正向引物：5′-TCAAGCCTTAGATTGGGATGTC-3′；反向引物：5′-CCAGAGATTGATTTGGGAATTTGTG-3′，共144 bp。TLR9：正向引物：5′-AGTCCTCGACCTGGCAGGAA-3′；反向引物：5′-GCGTTGGCGCTAAGGTTGA-3′，共168 bp。β-actin：正向引物：5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′；反向引物：5′-GGATAGCACAGCC TGGATAGCAAC-3′，共156 bp。PCR 反應擴增條件：94 ℃預變性5 min，50 個循環（94 ℃，變性30 s；53 ℃，退火30 s；72 ℃，延伸30 s）。每輪PCR 反應重復兩次。根據待測標本的Ct 值，以β-actin 為內參照，采用相對定量法，以2-△Ct表示標本中TLR7 和TLR9 基因相對表達量。為了顯示與健康對照組的變化比例，所有TLR7 和TLR9 相對表達量值被除以健康對照組的均值，進行標準化計算。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件儲存和分析數據。計量資料以均數±標準差表示。兩組計量資料采用t檢驗或Kruskal-Wallis 非參數檢驗，兩組計數資料采用卡方檢驗。多組均值比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用事件后Tukey 檢驗。不同臨床檢測指標與TLR7 和TLR9 的相對表達量進行單因素直線相關分析，雙變量資料計算Pearson 相關系數，抗體滴度資料采用Spearman 等級相關分析。相關分析中P＜0.1 的變量進入線性回歸分析，采用步進法篩選模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR7 和TLR9 mRNA 在SLE 患者和健康對照組PBMC 的表達水平 反轉錄PCR 顯示TLR7和TLR9 在SLE 患者和健康對照組的PBMC 細胞中均有表達。通過定量PCR 測定TLR7 和TLR9 的轉錄水平，與健康對照組相比，初次診斷組SLE患者的TLR9 轉錄水平增高至（162 ± 58）%；TLR7 初次診斷組的mRNA 水平提高更為顯著，達（207±45）%，差異均具有統計學意義（P＜0.01，圖1）。激素治療組TLR7 和TLR9 的表達低于初次診斷組，兩組間的差異僅在TLR7 存在統計學意義（P＜0.01）。激素治療組的TLR7 和TLR9 仍高于健康對照組（P＜0.05）。

2.2 SLE 患者PBMC 的TLR7 和TLR9 轉錄水平與SLE 活動指數的相關關系 由于糖皮質激素治療與SLE 病情活動具有密切聯系，有必要首先探討SLE 病情活動與TLR7 和TLR9 表達的相關關系。將兩組的TLR7 和TLR9 相對轉錄水平與SLE活動指數（SLEDAI）制作散點圖（圖2），相關分析顯示TLR7 與TLR9 均與SLEDAI 存在正相關關系（P＜0.01），TLR9 與SLEDAI 的Pearson 相關系數為0.566，高于TLR7（r=0.401）。為排除糖皮質激素治療的影響，單獨對初次診斷組進行SLEDAI 與SLE 活動指數的相關分析，結果顯示TLR7 與SLEDAI 的相關系數為0.107；而TLR9 與SLEDAI 的相關系數為0.506（P＜0.05）。

圖1 定量PCR 檢測TLR7 和TLR9 在SLE 患者和健康對照組PBMC 的轉錄水平Fig.1 Quantification of TLR7 and TLR9 mRNA expression in the PBMC isolated from SLE patients and healthy controls using real-time PCR

圖2 SLE 活動指數與PBMC 細胞TLR7 和TLR9 基因轉錄水平的相關關系Fig.2 Correlation of SLEDAI score with TLR7 and TLR9 mRNA levels in PBMC

2.3 SLE 患者臨床表征與TLR7 和TLR9 基因轉錄水平的關系 兩組患者的病史、臨床特征和實驗室檢查資料見表1。為了進一步探討與TLR7、TLR9 表達的可能相關因素，利用相關分析評價SLE 患者不同的臨床指標與TLR7 與TLR9 表達的聯系。如表2所示，TLR7 的轉錄水平與SLEDAI、抗Sm 抗體滴度成正相關關系（P＜0.05）。對于TLR9，年齡、SLEDAI 和抗dsDNA 抗體滴度等變量與之具有正相關關系（P＜0.05）。糖皮質激素治療指標包括劑量和療程與TLR7 的相關性無統計學意義，而劑量與TLR9 的表達具有一定的相關關系（r=0.362，P=0.082）。將簡單相關分析中P＜0.1 的可能指標利用多元線性回歸模型進一步篩選影響TLR7 和TLR9 表達的相關變量（表3）。結果顯示與TLR9 表達相關的變量（P＜0.05）根據偏相關系數的大小依次為SLEDAI、C4 水平和糖皮質激素劑量；而TLR7 轉錄水平僅發現與SLEDAI 具有正相關關系。

表1 入組SLE 患者的臨床表征和實驗室檢查Tab.1 Demographic and clinical characteristics of SLE patients

表2 不同臨床特征、實驗室指標與TLR7、TLR9 轉錄水平的二元變量相關分析Tab.2 Bivariate correlation analysis between TLR7，TLR9 mRNA levels and clinical features in SLE patients

表3 多元線性回歸分析TLR7 和TLR9 轉錄水平的預測變量Tab.3 Predictive factors associated with TLR7 and TLR9 mRNA expression levels in multivariate linear regression

3 討論

TLRs 是一種重要的先天性免疫識別受體，能夠識別病原微生物對機體的入侵，觸發免疫應答，對機體的免疫調節具有至關重要的作用。TLRs的配體分為外源性配體和內源性配體。所謂外源性配體是指來自宿主外的病原微生物成分，而內源性配體主要指來自宿主細胞的一些物質，如宿主細胞在應激狀態或損傷時釋放的熱休克蛋白或核酸等。近年越來越多的研究［8，12］證實TLRs 不僅識別外源侵入的微生物病原體，還能夠識別內源性分子，尤其是SLE 相關抗原。

SLE 的特征是抗核抗體的血清水平升高，而抗核抗體是一組針對細胞核內的核酸-蛋白質分子復合物而產生的自身抗體。識別核酸的TLRs 主要是TLR3、TLR7 和TLR9 這3 種亞型。與在細胞表面上表達的其他TLRs 不同，3 種核酸特異性TLRs 定位于內體中。TLR3 結合雙鏈RNA，TLR7結合單鏈RNA，TLR9 結合未甲基化的DNA。目前已有研究［13-15］提示TLR7 和TLR9 對SLE 患者的自身抗原的產生有重要作用。既往報道［10］顯示SLE患者總PBMC 中TLR7 和TLR9 mRNA 的表達量較對照組增高，并且與IFN-α表達相關。活動期SLE患者相比緩解期，其B 淋巴細胞和單核細胞TLR9的表達增加［16］。在SLE 患者中，TLR9 的表達與SLEDAI、抗dsDNA 抗體正相關，而與C3、C4 負相關［17］。然而，部分研究結果［10］顯示SLE 組與健康對照組之間TLR7 表達無差異。這可能與受試者之間的高度變異有關。有研究顯示［18-21］不同種族人群的TLR7 和TLR9 單核苷酸多態性與SLE 的相關性具有不同的特點，TLR7 和TLR9 的表達水平也存在種族差異。本研究主要以南方漢族人的研究對象，提示SLE 患者PBMC 的TLR7 和TLR9 mRNA 轉錄水平增高具有統計學意義，并與SLE 的病情活動程度指標SLEDAI 具有正相關關系（P＜0.05）。然而，TLR7 和TLR9 的關聯因素并不一致。TLR9 與SLEDAI 的Pearson 相關系數為0.566，高于TLR7。在排除糖皮質激素治療影響的初次診斷組中，SLEDAI 與TLR9 的相關性具有統計學意義，而與TLR7 無統計學意義。此外，TLR9 還與年齡、抗dsDNA 抗體的相關性具有統計學意義，而TLR7 僅與SLEDAI 抗Sm 抗體相關。與相關分析研究結果相符的是，TLR9 主要用于識別雙鏈DNA（dsDNA），而TLR7 識別核內RNA，而Sm 抗原主要由小核RNAs 形成的蛋白復合物。TLR9 與抗dsDNA 抗體，TLR7 與抗Sm 抗體的獨特相關性提示了不同TLRs 介導的機制在相關核抗原的自身免疫應答的發展起重要作用。在動物實驗中，用RNA和DNA-蛋白質復合物刺激TLR7 和TLR9 均可誘導樹突細胞和自身反應性B 細胞的過度活化，導致高滴度的自身抗核抗體［13-14］。研究推測，SLE 患者體內凋亡或壞死的細胞釋放出核酸，而機體免疫系統又缺乏對此核酸抗原清除的能力，異常高表達的TLR7 和TLR9 通過識別釋放出的單鏈RNA或DNA，激活處于靜止狀態的自身免疫細胞，從而導致SLE 患者自身抗體的產生。值得注意的是，雖然TLR7 和TLR9 具有相似的表達模式并共享相同的信號傳導途徑［22］，但是在SLE 小鼠模型中敲除TLR7 或TLR9 基因卻得到相反的結果：TLR7 缺失可抑制SLE 的病理生理過程；而TLR9 缺失卻表現自身免疫性皮膚病的發生率明顯升高，狼瘡性腎炎加重，病死率增高［23-25］。TLR7 和TLR9 在SLE疾病發展過程中的作用仍有待進一步明確。

糖皮質激素既是人體內重要的生理物質，又是臨床廣泛應用的免疫抑制劑。在體內，由腎上腺皮質球狀帶分泌的類固醇激素，主要包括皮質醇和皮質酮。臨床作為藥物使用的糖皮質激素主要包括氫化可的松、潑尼松（強的松）、地塞米松等，其藥理作用主要包括抗炎、免疫抑制、抗休克和抗毒作用。糖皮質激素作為SLE 患者治療的基礎用藥，與介導固有免疫應答的模式識別受體（如TLR7 和TLR9）的關系仍不清楚［17，26］。本研究通過比較糖皮質激素治療的SLE 患者組和未受糖皮質激素治療的初次診斷組，研究其TLR7 和TLR9 的mRNA 表達水平，結果提示糖皮質激素治療組的TLR7 和TLR9 的mRNA 水平均低于初次診斷組，其中TLR7 差異具有統計學意義。兩組TLR7 和TLR9 的表達水平仍高于健康對照組。由于糖皮質激素治療可導致SLE 病情活動和多項免疫指標的改變，單純的組間比較或相關分析難以確定糖皮質激素治療對TLR7 和TLR9 的影響。因此，用療程和日均劑量兩個參數定義糖皮質激素治療水平，通過多元線性回歸模型篩選影響TLR7 和TLR9 表達的變量。結果提示TLR7 主要相關變量為SLEDAI，而TLR9 的主要相關變量包括SLEDAI、補體C4 水平、糖皮質激素日均劑量。多項研究表明，糖皮質激素可以影響免疫細胞的分化發育、表型特征、抗原攝取和抗原加工提呈等多種生物學功能。ROZKOVA 等［27］發現糖皮質激素使樹突細胞TLR2、TLR3 和TLR4 mRNA 表達增加，但是這種TLRs 表達調節具有雙向性，與細胞的功能狀態有關，并與糖皮質激素的濃度正相關。盡管這些研究結果支持了糖皮質激素治療對TLRs 的表達調節，仍需要進一步的大樣本縱向研究設計，包括前瞻性的隊列研究等，確定在SLE 患者中TLRs表達變化與糖皮質激素治療的時間關系和劑量反應性。

綜上所述，本研究對初次診斷和經糖皮質激素治療的SLE 患者進行總PBMC 的TLR7 和TLR9的表達分析，與既往研究一致，結果顯示SLE 患者TLR7 和TLR9 的表達增高，與病情活動指數正相關，TLR9 的表達還與糖皮質激素治療劑量和補體C4 存在較高的相關性。TLR7 和TLR9 異常表達和活化可能在SLE 疾病進程和糖皮質激素治療中發揮作用。進一步闡明TLR7 和TLR9 在自身免疫反應發展中的精確分子作用將有助于優化SLE 治療策略。