HPLC法測定豬血漿中帕托珠利的方法學建立

沈佳晨，霍浩遠，全家興，李小龍，卜仕金

（揚州大學獸醫學院／江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇揚州225000）

帕托珠利（Ponazuril），又名妥曲珠利砜（Toltrazuril sulfone），化學名為1-甲基-3-［3-甲基-4-（4-三氟甲基砜基-1-苯氧基）-苯基］-［1，3，5］-三嗪-［2，4，6］-三酮，分子式C18H14F3N3O6S。帕托珠利屬三嗪酮類藥物，主要用于治療原蟲疾病，該藥最早由德國Bayer 公司開發，并于2001年經FDA 批準在美國上市。帕托珠利對球蟲的各個發育階段都有效果，具有用藥量低，安全性高，無耐藥性等特點［1］，憑借其強大的抗原蟲效果以及相對低廉的價格，在其上市后就迅速占領美國市場［2］。目前測定帕托珠利的方法主要有HPLC［2-4］法和LC-MS［5-7］法兩種，研究采用的是HPLC 法，旨在建立一種可以在豬血漿中準確快速測定帕托珠利含量方法，以期為研究帕托珠利在豬體內的代謝動力學提供基礎。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 高效液相色譜儀：Agilent 1260，安捷倫公司；電子分析天平：感量0．0001 g，德國賽多麗絲天平公司；超聲儀：KS-250D，寧波科生儀器廠；超純水設備：UPH-11-20T，成都超純科技有限公司；氮吹儀：Organomation Associates 公司；臺式高速離心機：Centrifuge 5810 R，Eppendorf 公司；微量移液器：10、200、1000 μL，Eppendorf 公司。

帕托珠利對照品（含量99．6%，批號：180502WS）購自湖北龍翔藥業科技股份有限公司；甲醇，色譜純，購自美國TEDIA 公司；乙腈，色譜純，購自美國TEDIA 公司；乙酸，色譜純，購自德國CNW 公司；乙酸乙酯，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1．2 方法

1．2．1 提取方法 準確吸取200 μL 血漿于2 mL 離心管中，加入1 mL 乙酸乙酯渦旋3 min，12000 r／min離心10 min，將上清液移至10 mL 離心管中，下層殘渣用0．5 mL 乙酸乙酯重復提取一次，合并上清液并于氮氣下吹干。氮吹后的殘渣用200 μL 流動相復溶，12000 r／min 離心10 min，取上清經0．22 μm有機濾膜過濾，濾液供HPLC 分析。

1．2．2 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0．2%乙酸水溶液（53 ∶47，V／V）；流速1 mL／min；紫外檢測波長250 nm；柱溫35 ℃；進樣量：20 μL。

1．2．3 試液的配制 標準儲備液與質控儲備液：準確稱取約10 mg 帕托珠利標準品于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容并稀釋至刻度，濃度為1 mg／mL，于-20 ℃保存。質控儲備液于做穩定性試驗當日配。工作液：準確吸取適量帕托珠利標準儲備液，用流動相稀釋成一定濃度的系列濃度的標準工作液，現配現用。

1．3 方法學驗證

1．3．1 準確度與精密度的測定 按照生物樣品定量分析指導原則，用質控儲備液配制定量限、低、中、高四個血漿濃度添加水平，即0．1、0．2、5、7．5 μg／mL四個血漿添加濃度。以1．2．1 項的前處理方法進行處理后，按照1．2．2 項的條件進行檢測。每批每個濃度制備5 個平行，連續3 d。測定結果帶入當天繪制的標曲中，計算回收率以及變異系數。

1．3．2 穩定性考察 按照生物樣品定量分析指導原則，采用低和高濃度質控樣品進行穩定性的考察。

1．3．2．1 儲備液在凍存條件下的穩定性 用質控儲備液配制濃度為0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利標準工作液，每個濃度15 個平行，并分別于0、30、60 d上機分析。通過與第0 天數據比較，考察儲備液凍存期間（-20 ℃）的穩定性。

1．3．2．2 血漿樣品在凍存條件下的穩定性 用質控儲備液配制濃度為0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血漿添樣品，每個濃度15 個平行，并于-20 ℃條件下凍存。分別在0、30、60 d 對樣品進行分析。通過與第0 天數據比較，考察血漿樣品凍存期間（-20 ℃）的穩定性。

1．3．2．3 血漿樣品反復凍融的穩定性 用質控儲備液配制濃度為0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血漿添樣品，每個濃度10 個平行。每個濃度的5 個平行立刻處理分析，得到0 時數據。其余樣品在-20 ℃凍存1 d 后取出解凍，之后再次冷凍、解凍，反復3次循環處理，兩次凍融時間間隔至少為5 h。通過與0 時數據比較，考察血樣反復凍融的穩定性。

1．3．2．4 血漿樣品在室溫放置的穩定性 用質控儲備液配制濃度為0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血漿添樣品，每個濃度5 個平行，并立刻處理分析，得到0 時數據，之后在室溫（約20 ℃）6 h 后進行樣品分析。通過與0 時數據比較，考察血樣室溫放置的穩定性。

2 結果與分析

2．1 色譜行為 由帕托珠利標準品、空白血漿、空白添加樣品的分離圖譜可知，空白血漿與雜質對帕托珠利出峰無明顯干擾，帕托珠利出峰良好，保留時間在9 min 左右（圖1）。

圖1 HPLC 色譜圖（A、B、C 分別為空白血漿、0．1μg／mL 帕托珠利標準品、空白血漿添加0．1μg／mL 帕托珠利標準品）Fig 1 HPLC chromatograms（A，B，and C are respectively blank plasma，ponazuril standard at 0．1μg／mL and spiked pig plasma at the level of 0．1μg／mL）

2．2 標準曲線和線性范圍 由表1所示帕托珠利在0．10～10．00 μg／mL 濃度范圍內，標準工作液中帕托珠利與峰面積呈良好的線性關系（r≥0．999）（表1）。以標準工作液藥物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制的標準曲線見圖2。

表1 帕托珠利標準回歸方程及相關系數Tab 1 Linear regression equation and correlation coefficient of ponazuril

圖2 帕托珠利標準曲線圖Fig 2 Standard working cure of ponazuril

2．3 檢測限和定量限 帕托珠利在豬血漿中的最低檢測限為0．04 μg／mL，最低定量限為0．1 μg／mL。

2．4 準確度和精密度 豬血漿中帕托珠利測定方法準確度和精密度的測定結果見表2。由表2可見，豬血漿樣品在0．1～10 μg／mL 時，批內和批間回收率均大于90%，批內和批間變異系數均小于9%，該方法符合生物樣定量分析指導原則的要求且重復性良好。

2．5 穩定性 帕托珠利儲備液穩定和血漿樣品穩定性的考察結果分別見表3和表4。結果顯示，儲備液凍存穩定（RSD＜4%），血漿樣品凍存穩定（RSD＜8%），血漿樣品反復凍融后穩定（RSD＜6%），血漿樣品室溫放置穩定（RSD＜4%），表明帕托珠利在整個實驗中過程中基本沒有降解。

表2 血漿樣品中帕托珠利的相對回收率和精密度Tab 2 The recovery of ponazuril and the precision determination in plasma

表3 帕托珠利儲備液在-20 ℃儲存條件下的穩定性Tab 3 The stability of ponazuril stock solutions stored at -20 ℃

表4 帕托珠利血漿樣品的穩定性Tab 4 The stability of ponazuril in plasma

3 討論與結論

3．1 色譜條件的優化 根據文獻報道，本實驗分別嘗試了以甲醇-水、甲醇-0．2%乙酸水、乙腈-水、乙腈-0．2%乙酸水作為流動相。結果顯示，以甲醇-水和甲醇-0．2%乙酸水系統作為流動相時，分離效果不理想，藥物洗脫時間過長；而以乙腈-水體系作為流動相時，主峰會出現拖尾現象，因此，選擇乙腈-0．2%乙酸水作為流動相。在本研究中發現，適當提高乙腈在流動相中的比例，可極大程度縮短帕托珠利的保留時間，當乙腈在流動相中的比例達到57%時，主峰可與雜峰完全分離。在柱溫低于35 ℃時，低濃度樣品主峰峰形較差，由于柱溫過高會減少色譜柱的使用壽命，故選擇柱溫35 ℃，在此條件下，帕托珠利的出峰時間在9 min 左右。由于在豬血漿樣品中20 min 左右會出現干擾雜峰，為了不影響下一個樣品的檢測，選擇13 min 作為一個樣品的分析周期。

3．2 提取條件的優化 據文獻報道，帕托珠利樣品的提取劑選擇主要有乙酸乙酯［3］、乙腈［8-10］、甲醇［1］等，本試驗分別對這3 種提取劑進行了考察，結果發現，3 種提取劑的提取回收率均可達到90%左右，但乙腈和甲醇屬于蛋白沉淀劑，提取后所含雜質較多，影響低濃度樣品測定的準確性。而乙酸乙酯的提取屬于液液萃取，相比于蛋白沉淀，提取后雜質明顯減少，同時乙酸乙酯的揮發性強于其他提取劑，可明顯縮短氮吹時間，提高工作效率。

研究所建立的豬血漿測定帕托珠利的方法操作簡單，靈敏度高，血漿中帕托珠利的線性范圍為0．1～10 μg／mL，樣品回收率高，平均回收率大于90%，能夠準確測定各個時間點的血漿藥物濃度。在方法學論證和穩定性考察中，準確度、精密度和各個階段的穩定性均符合生物樣定量分析指導原則的要求，能夠保證檢測結果的準確性和重現性。