HPLC-PDA法測定恩諾沙星注射液中非法添加乙酰甲喹和水楊酸

薄永恒，李淑煥，李有志?，馮 濤，徐紅瑋，張 琦

（1．山東省獸藥質量檢驗所／山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南250022；2．山東省農業工程學院食品科學與工程學院，濟南250100）

恩諾沙星注射液收載于《中國獸藥典》2015 版第一部［1］，為廣譜殺菌藥，對大腸桿菌、沙門氏菌等都有殺菌效用，主要治療由此病菌引起的消化系統、呼吸系統疾病。乙酰甲喹商品名稱為痢菌凈［2］，獸醫臨床主要用于禽巴氏桿菌病、雛雞白痢等。水楊酸屬于非甾體抗炎藥，常用于緩解家畜的發燒、感冒時的體溫升高及關節疼痛等癥狀［3］。當前，某些不法獸藥生產企業為了擴大恩諾沙星藥物的療效，而隱蔽乙酰甲喹和水楊酸的使用，在恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹和水楊酸的現象時有發生，造成乙酰甲喹和水楊酸的混亂使用，且不能執行其休藥期，最終造成動物性食品中殘留乙酰甲喹和水楊酸的嚴重后果。目前，關于乙酰甲喹和水楊酸的含量檢測方法的報道較多，主要包括紫外可見分光光度法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。由于獸藥制劑之間的檢測方法差距較大，檢測量上不在同一個級別，而且藥物成分之間存在相互干擾［4］，因此，急需開發一種同時檢測恩諾沙星、乙酰甲喹和水楊酸的的方法，用以檢測恩諾沙星注射液中乙酰甲喹和水楊酸的存在。為利于地市縣等獸藥檢驗部門開展獸藥非法添加的檢驗工作，本研究將建立科學、有效、簡單的恩諾沙星注射液中非法添加乙酰甲喹和水楊酸的檢測技術，以有效杜絕非法添加的問題。

1 材 料

1．1 儀器 Waters 2695e 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器，美國Waters 公司；XS-205 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1．2 試劑與材料 甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA 公司，其余試劑均為分析純；實驗用水為milli-Q超純水。乙酰甲喹對照品（中國獸醫藥品監察所，批號：H0401204，含量：99．6%）；恩諾沙星（中國獸醫藥品監察所，批號：H0081505，含量：99．5%）；水楊酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：130451-201203，含量：84．2%）。

2 方 法

2．1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18 色譜柱，（4．6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0．025 moL／L磷酸溶液∶乙腈＝85 ∶15（V∶V）；流速1．0 mL／min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；二極管陣列檢測器參考條件：定性采集波長范圍200～400 nm；定量波長232 nm。

2．2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液 量取恩諾沙星注射液0．5 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL 置50 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．2．2 對照品溶液 稱乙酰甲喹、水楊酸對照品50 mg（準確至0．01 mg），置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取1 mL 置100 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品工作液。

2．2．3 系統適應性溶液 分別精密量取乙酰甲喹、水楊酸對照品儲備液100 μL 和200 μL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，即得。

2．2．4 陰性添加溶液 分別精密量取乙酰甲喹、水楊酸對照品儲備液適量，置10 mL 量瓶中，用陰性無添加的恩諾沙星注射液的供試品溶液稀釋并定容至刻度。

2．3 方法學考察

2．3．1 系統適用性試驗 乙酰甲喹、水楊酸在試驗條件下完全分離，分離度均大于1．5，各化合物的色譜峰理論塔板數均大于5000，方法專屬性良好。系統適應性溶液色譜圖（圖1）及相應對照品光譜圖（圖2）。

圖1 水楊酸（濃度20μg／mL）、乙酰甲喹（濃度10μg／mL）色譜圖Fig 1 Chromatogram of salicylic acid （20μg／mL） and acetoquine （10μg／mL）

圖2 乙酰甲喹、水楊酸光譜圖Fig 2 Spectrum of acetoquine and salicylic acid

2．3．2 線性范圍 精密稱乙酰甲喹、水楊酸對照品50 mg（準確至0．01 mg），置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。用流動相分別配制水楊酸、乙酰甲喹的混合標準溶液5 種，濃度分別為50、20 μg／mL、20、10 μg／mL、10、5 μg／mL、2、1 μg／mL、1、0．5 μg／mL。從低濃度到高濃度一次注入液相色譜儀測定，以峰面積為縱坐標，相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線，水楊酸、乙酰甲喹標準工作曲線回歸方程分別為：y＝35628．467x-4908．954、y＝58342．897x+2297．349，相關系數R2分別為1．000、1．000。結果表明在線性范圍內，水楊酸、乙酰甲喹濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

2．3．3 峰純度檢查 對陰性空白添加樣品的光譜圖中兩個目標化合物進行峰純度檢查，結果見圖4～圖5和表1。結果顯示，陰性空白在232 nm處有吸收值，但與兩個目標化合物有較大分離，分離度大于1．5，達到很好的分離，如圖3，且各色譜峰的純度角度均小于純度閾值，表明此色譜條件下，兩個目標化合物的出峰位置無其他干擾峰，為單一物質，方法可行。

圖3 水楊酸（濃度20 μg／mL）、乙酰甲喹（濃度10 μg／mL）的陰性添加溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of salicylic acid （20 μg／mL） and acetoquine （10 μg／mL） in negative addition solution

圖4 陰性空白添加水楊酸的純度圖Fig 4 Purity diagram of the addition of salicylic acid to the negative blank

圖5 陰性空白添加乙酰甲喹的純度圖Fig 5 Purity map of acetaminoquin added to negative blank

表1 峰純度檢查結果表Tab 1 Peak Purity Check Results Table

2．3．4 靈敏度試驗 在陰性樣品中添加乙酰甲喹、水楊酸標準溶液，獲得0．5 μg／mL 和0．25 μg／mL 的添加乙酰甲喹終濃度樣品和1 μg／mL 和0．5 μg／mL的添加水楊酸終濃度樣品，進行檢測，以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢出限［5］。水楊酸在0．5 μg／mL的添加終濃度下，光譜圖已失真，如圖6，因此，水楊酸的最低檢出限濃度為1 μg／mL，在恩諾沙星注射液中的檢出限為0．5 mg／mL；乙酰甲喹在0．25 μg／mL 的添加終濃度下，光譜圖已失真，如圖7，因此，乙酰甲喹的最低檢出限濃度為0．5 μg／mL，在恩諾沙星注射液中的檢出限為0．25 mg／mL。

圖6 水楊酸的檢出限光譜圖（0．5mg／mL）Fig 6 Spectral map of salicylic acid detection limit （0．5mg／mL）

圖7 乙酰甲喹的檢出限光譜圖（0．25mg／mL）Fig 7 Spectral map of detection limit of acetoquine （0．25mg／mL）

2．3．5 準確度和精密度試驗 取制得的陰性空白溶液，分別加入適量的1 mg／mL 的水楊酸和乙酰甲喹標準溶液適量，制成高添加濃度樣品（水楊酸20 μg／mL，乙酰甲喹10 μg／mL），中添加濃度樣品（水楊酸10 μg／mL，乙酰甲喹5 μg／mL），低添加濃度樣品（水楊酸2 μg／mL，乙酰甲喹1μg／mL）。每個濃度三份平行樣品。計算回收率以及相對標準偏差。結果顯示水楊酸平均回收率為99．51%；乙酰甲喹平均回收率為99．62%；相對標準偏差RSD在0．07%～3．44%之間，結果見表2～表3。

表2 恩諾沙星注射液中乙酰甲喹添加回收率實驗結果Tab 2 Experimental results of recovery of acetoquine in enrofloxacin injection

表3 恩諾沙星注射液中水楊酸添加回收率實驗結果Tab 3 Experimental results of salicylic acid addition recovery rate in enrofloxacin injection

續表

2．3．6 穩定性試驗 取同一陰性添加溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣10 μL，記錄色譜峰面積，乙酰甲喹、水楊酸峰面積的RSD均小于0．4%。結果表明供試品溶液在室溫下放置24 h 穩定。

2．3．7 耐用性 從柱溫及色譜柱兩個方面考察方法的耐用性。改變柱溫為20、25、30、40 ℃，出峰順序無變化，保留時間稍有變化。使用不同品牌、不同型號的色譜柱，例如，Thermp HypersiL GoLd（4．6×250 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（4．6×150 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（3．5×150 mm，5μm）等，結果3 種成份仍能很好的分離且出峰時間理想。最佳實驗條件的選擇中流速的變化對3 種成份的影響也不大，本方法的耐用性良好。

3 討論與結論

3．1 流動相選擇 根據《中國獸藥典》2015 版第一部恩諾沙星注射液的含量測定方法，設定了流動相0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈的比例，分別為83 ∶17，85 ∶15，90 ∶10，結果顯示在流動相0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈體積比為85 ∶15 時，恩諾沙星、乙酰甲喹、水楊酸的分離度符合分離的要求，因此，選擇0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈（85 ∶15）為流動相。

3．2 吸光度選擇 由于在乙酰甲喹最大吸收值時，水楊酸的的吸收度較低，在水楊酸的最大吸收值232 nm 作為定量波長時，乙酰甲喹也有較大吸收，以便獲得最準確的吸收值，因此，選擇232 nm作為方法的吸收波長。

3．3 光譜圖的處理 作為定性的最主要圖譜，對陰性空白添加樣品的光譜圖中兩個目標化合物進行峰純度檢查，當純度角度小于純度閾值時，判定為此出峰物質為單一物質，同時與標品光譜圖比對出峰時間一致時，判定為此物質為對應出峰時間的標準物質添加，以此為添加物定性標準。

本方法采用二極管陣列檢測器進行檢測，實現了恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹、水楊酸的定性定量檢測。同時可以通過峰純度檢查鎖定非法添加物，通過保留時間與對照品進行對比，實現了恩諾沙星注射液中非法添加物的高效、快速、準確識別，成功建立了恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹、水楊酸的測定——高效液相色譜法。本方法乙酰甲喹檢出限為0．25 mg／mL、水楊酸檢出限為0．5 mg／mL。