HPLC法測定芪貞增免顆粒、蛋雞寶中淫羊藿苷的含量

章安源，章安雯，張志民，陳 玲，李有志?

（1．山東省獸藥質量檢驗所，山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南250022；2．棗莊職業學院，山東棗莊277100）

淫羊藿是使用悠久的傳統中藥之一，其主要有效成分是黃酮類化合物淫羊藿苷［1］?，F代藥理學研究發現，淫羊藿苷具有多種生物活性［2］，并有抗缺氧、抗氧化等多種生物學功效［3-4］。淫羊藿來源于小檗科淫羊藿屬植物Epimedium L 干燥葉，以淫羊藿為主藥的制劑很多，如芪貞增免顆粒和蛋雞寶，相關標準僅用薄層和顯微鑒別淫羊藿苷［5］，淫羊藿藥材種類多，鑒別困難。采收于夏秋的淫羊藿藥材地上部分花果已脫落，僅存葉片和葉柄，藥材中殘存一些花序軸和果梗，可作為補充特征，若藥材僅有葉片，可利用鑒別的特征就更少［6］。統計表明淫羊藿藥材各藥用部位中淫羊藿苷含量均為葉＞根＞莖［7］，中成藥在投料的過程中若投入淫羊藿莖及地下部分，僅靠當前的質量評價方法難以鑒別［8］。未對含量進行控制，不能全面反映制劑的質量水平，達不到制劑治療效果。

本實驗室首次應用HPLC 對芪貞增免顆粒和蛋雞寶中淫羊藿苷進行定量研究，方法快速、準確。為控制本制劑的質量提供標準依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器與設備 高效液相色譜儀Waters e2695（配二極管陣列檢測器2998）；AE-240 電子天平（瑞士Mettlrer Toledo 公司）；KQ - 250DB 超聲儀（昆山市超聲儀有限公司）；

1．2 試藥與試劑 淫羊藿苷（批號：110737-201516，含量94．2%）；購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（Merck，色譜純）；水為超純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipso XDB-118 C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相A：乙腈；流動相B：水［5］；流速：1 mL／min；進樣量10 μL；柱溫為30 ℃。檢測波長范圍270 nm，結果見表1。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution

2．2 溶液制備

2．2．1 對照品溶液 精密稱取淫羊藿對照品適量，加甲醇配制成濃度為100 μg／mL 的對照品溶液。結果見圖2。

圖2 淫羊藿對照品溶液Fig 2 Control solution

2．2．2 標準工作液的制備 取適量2．2．1 項下溶液，用初始流動相稀釋，制備成系列濃度為5、10、25、50、100、200、250、400 μg／mL 標準工作液，繪制標準曲線。

2．2．3 供試品溶液制備 取樣品充分研磨，精密稱取1．0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇25 mL，稱定重量，超聲（120 W，頻率40 kHz），超聲水浴溫度40 ℃，處理30 min，放冷，用40%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液后再次精密加入40%甲醇25 mL，合并兩次濾液后，0．22 μm 微孔濾膜濾過，即得［5］。對照品與供試品出峰時間相一致。結果見圖3和圖4。

圖3 芪貞増免顆粒Fig 3 Sample solution of Qizhenzengmian Granule

圖4 蛋雞寶Fig 4 Sample solution of Danjibao Powder

2．2．4 陰性樣品 取除淫羊藿的其它藥材適量，按樣品的制備工藝和配方比例制備陰性樣品，按2．2．3 項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2．2．5 陽性添加樣品 精密稱取已知含量的同批樣品（山東某獸藥生物有限公司提供）6 份，分別精密加入適量對照品，置于25 mL 容量瓶中，按2．2．3項下方法混合均勻制成陽性添加樣品溶液。

2．3 方法線性考察 分別精密吸取2．2．2 項下標準工作液10 μL，在2．1 項色譜條件下注入儀器，以峰面積為橫坐標（X），濃度（μg）為縱坐標（Y），回歸方程Y＝0．0004X-0．2941，R2＝0．9998；結果表明，淫羊藿苷在5～400 μg 與其對應的峰面積有良好的線性關系。

2．4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL 注入色譜儀，連續進樣6 次。以峰面積計算，得出淫羊藿苷的RSD2．11%。表明儀器精密度良好，符合檢測要求。

2．5 重復性試驗 同批供試品（批號為20180201，山東某獸藥生物科技有限公司提供），按2．2．3 項下制備6 份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，計算淫羊藿苷含量，RSD為1．4%，說明該方法重現性好，含量穩定。

2．6 穩定性試驗 取2．2．3 項下同一供試品溶液（批號：20180201），室溫下每隔4 h 連測6 次，進樣體積20 μL，淫羊藿苷峰面積RSD分別為0．93%，0．89%、0．91%，表明本制劑在制備后的24 h 內成份較穩定。

2．7 回收率試驗 取2．2．5 項下溶液2 mL，按2．1項下條件測定淫羊藿苷含量?；厥章试?2．02%～92．22%之間，變異系數在1．54%～1．88%之間，見表2-表3。表明該方法回收率較好，準確度和精密度可以滿足檢測需求。

表2 芪貞增免顆粒中淫羊藿苷回收率試驗（n=6）Tab 2 Recovery of icariin of Qizhenzengmian granule

表3 蛋雞寶中淫羊藿苷回收率試驗（n=6）Tab 3 Recovery of icariin of Danjibao powder

2．8 樣品測定 精密稱取不同企業芪貞増免顆粒，蛋雞寶樣品，按2．2．3 項下方法制備供試品溶液，每份樣品測定2 次，以2 次測定結果的平均值作為測定值，結果見表4。

表4 樣品測定結果（n=6）Tab 4 The resultof the sample content

2．9 檢出限和定量限 取“2．2．4”項下溶液，色譜圖顯示無淫羊藿成分干擾，應用本試驗建立的檢測方法，添加對照品0．5 μg／mL，取與對照品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值，信噪比（S／N）≥3，確定為方法的檢出限。添加對照品10 μg／mL 顯示信噪比（S／N）≥10，作為此方法定量限。

3 討論與結論

3．1 供試品前處理提取方法的選擇 Jang 等以提取溶液濃度、提取溫度、溶液pH、液料比及提取時間為因素，發現在各因素中，提取溶液濃度及提取溫度是影響提取率的主要因素［9］。試驗中著重考察以上條件因素。選擇6 種不同濃度提取溶劑：乙醇30%、40%、50%和30%、40%、50%甲醇［10-13］，結果表明40%甲醇溶解樣品不易結團，溶解性最好且提取率最高，檢測樣品雜質峰少。分別采用回流和超聲不同方式提取，超聲水浴溫度控制在20 ℃、30 ℃、40 ℃，并考察了不同的提取時間［14-17］?；亓魈崛? h 后和超聲提取30 min 淫羊藿苷即可提取完全，考慮到超聲提取更加簡便、快速、故超聲處理30 min 來制備樣品。分別提取樣品2 次、3 次、4 次，超聲頻率40 kHz，水浴溫度控制在40 ℃，試驗結果顯示提取2 次與3 次、4 次的淫羊藿苷含量差異無統計學意義，為節約時間，提取2 次樣品即可滿足實驗需求［18］。

3．2 流動相的優選 《中國獸藥典》2015 版二部中淫羊藿藥材含量測定使用流動相是乙腈∶水（30 ∶70），但制劑中其它藥材對其分離度有影響，雜質多，故比較以下5 種流動相組進行梯度洗脫：乙腈-水（25 ∶75）、乙腈-0．05%磷酸（27 ∶73）［15］、乙腈-水（50 ∶50）［16］，乙腈-水（28 ∶72）［17］、乙腈-水（23 ∶77）［19］。經過比對發現使用乙腈-水（25 ∶75）梯度洗脫后淫羊藿苷峰分離度高，峰形對稱，并無拖尾及其它雜質峰的干擾。使用其他流動相顯示淫羊藿苷多在30 min 后出峰，出峰時間晚，此方法測定供試品方法穩定，準確度高，且節約時間。

3．2 色譜柱的選擇 使用不同型號的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱進行比較，HypersilBDS-C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）［15］，Cosmosil C18（250 mm×4．6 mm，5 um）［18］、Agilent Eclipso XDB-118 C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）進行比較，后者普通C18柱即可滿足淫羊藿苷測定方法的重復性需求，結果表明方法實用性及耐用性良好。

3．3 柱溫的確定 25 ℃和30 ℃、35 ℃柱溫進行考察，30 ℃柱溫時，基線平穩，柱壓穩定，對照品出峰時間與樣品時間一致，選擇30 ℃柱溫符合檢測要求。

3．4 影響淫羊藿苷含量測定的因素 淫羊藿苷含量測定結果表明來自于不同廠家芪貞增免顆粒和蛋雞寶含量差別較大，分析可能是不同產地淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量有差異［13］，也可能與藥材貯存有關［2］，其次或于顆粒劑與散劑不同的工藝制備過程中對藥物中有效成分有影響。

3．5 結論 采用現行標準中簡單的顯微鑒別特征和薄層色譜難以控制制劑和藥效的穩定性，難確保臨床療效。應完善制劑中淫羊藿苷含量質量標準。本實驗處理簡捷，快速，方法可靠，重現性及回收率均符合要求，適合測定淫羊藿苷的含量，可有效控制芪貞增免顆粒、蛋雞寶等方劑的內在質量。今后還需結合大生產繼續積累數據，考察產品的穩定性。也有研究認為以多指標來評價淫羊藿質量更為科學［13，15］。