9個產地6種楊樹花中水楊苷含量測定方法的優化及其分布研究

邱天寶，郝 哲，李華岑，劉素梅，韓 立

（1．河南省獸藥飼料監察所，鄭州450008；2．解放軍第九八八醫院，鄭州450042）

楊樹花收載于《中國獸藥典》2015年版二部，具有清熱解毒，化濕止痢［1-3］的功效，主治濕熱下痢，幼畜泄瀉。楊樹花的水煮液治療人和家畜的各類細菌性痢疾和腸炎［4］，對多種腸道細菌都有殺滅或抑制作用［5］，臨床效果良好，同時具有明顯的抗腫瘤、解熱鎮痛和抗風濕作用［6-7］。其中以水楊苷為代表的苷類化合物具有解熱、鎮痛作用［8-9］，藥用開發價值較高。楊樹花是常用獸藥，具有分布廣泛，價格低廉，療效確切等優點，深受養殖戶青睞，有廣闊的市場開發前景。目前楊樹花藥材的質量控制僅有理化鑒別和薄層鑒別，缺少對其品質的評價標準，本試驗對9 個產地6 種楊樹花中水楊苷的含量測方法進行了系統研究，為楊樹花質量標準的提升及品質評價提供了科學依據，具有很高的參考價值。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Waters2695 高效液相色譜儀，2998PDA檢測器（美國Waters 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER-AE240 型電子分析天平；移液器（德國eppendorf 公司）。超純水系統Mili-QAdvantageA10（美國MILLIPORE 密理博）。

1．2 試劑與對照品 水楊苷對照品（含量98．0%，批號4．530013．0001，ANPEL Scientific instrument Co．．Ltd．），乙腈為色譜純（默克股份兩合公司），甲醇為色譜純（默克股份兩合公司），水為娃哈哈純凈水經超純水系統制備，其余試劑均為分析純。

1．3 藥材 楊樹花于2018年4-6月采集，品種經河南省林科院鑒定，結果見表1。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 Waters XBrigeTMC18 柱（4．6 mm×150 mm，5 μm），流動相為水-甲醇-乙腈（92 ∶4 ∶4）；流速1．0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長267 nm；進樣體積10 μL。

表1 楊樹花產地及品種Tab 1 Origin and varieties of poplar flowers

2．2 對照品溶液的制備 水楊苷對照品溶液制備：取水楊苷對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2．3 供試品溶液的制備 取樣品粉末0．5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量；回流提取30 min，放至室溫，用50%甲醇補足重量，濾過，取續濾液，經0．45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2．4 線性范圍 取水楊苷對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL 量瓶中加甲醇稀釋至刻度作為儲備液，分別精密吸取水楊苷對照品儲備溶液1、2、3、4、5 mL 置10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度。照“2．1”項下色譜條件分別進樣，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度（mg／mL） 為橫坐標（X） 繪制標準曲線，并進行回歸，得水楊苷的回歸方程分別為：Y＝2．12e+006X-9．91e+003，（r＝0．9999），結果表明水楊苷在0．04208 mg／mL～0．4208 mg／mL 范圍內，線性關系良好。

2．5 精密度試驗 分別精密吸取同一份對照品溶液10 μL，重復進樣6 次，測定水楊苷峰面積，其RSD為0．4%，表明儀器精密度良好。

2．6 重復性實驗 取楊樹花藥材粉末5 份，每份0．5 g，精密稱定，按照“2．3”項下方法制備供試品溶液，照“2．1”項下色譜條件，測定水楊苷含量，RSD值為1．0%，表明該方法重復性良好。

2．7 穩定性試驗 楊樹花藥材粉末0．5 g，精密稱定，按“2．3”項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，10，12 h 照“2．1”項下方法，測定峰面積，RSD值為0．7%，表明供試品溶液在12 h 內基本穩定。

2．8 回收率試驗 取供試品0．25 g（平均含量為5．3 mg／g），精密秤定，分別按含水楊苷80%、100%、120% 加入水楊苷對照品儲備液，照“2．1”下方法測定水楊苷含量，計算平均回收率及RSD值，結果見表2。

2．9 耐用性 試驗考察安捷倫ZORBAX SB-C18（3．0×250 mm，5-Micron）、博納艾杰爾Venusil XBP C18（2）（4．6×150 mm，5 μm）、Waters Xbrige TM C18，（4．6×150 mm，5 μm） 三種不同品牌的色譜柱，照“2．1”項下方法測定不同品種楊樹花中水楊苷的含量，均能滿足要求，結果見表3。

表2 水楊苷回收率試驗（n=9）Tab 2 Recovery test of Salicin（n=9）

表3 耐用性試驗Tab 3 durability test

2．10 含量測定 分別取不同產地，不同品種楊樹花樣品，各3 批，按“2．3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按上述方法測定樣品中水楊苷的含量，結果見表4；水楊苷含量的分布圖見圖1。

3 討 論

3．1 供試品溶液制備方法考察

3．1．1 不同提取溶劑的考察 試驗考察了水、乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇5 種不同提取溶劑，比較不同溶劑提取水楊苷含量的差異。

取楊樹花粉末0．5 g，精密稱定，分別加水、乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放至室溫，用相應溶劑補足重量，濾過，取續濾液作為供試品溶液，照“2．1”項下方法測定其峰面積、分離度、峰面積、峰高理論塔板數、峰純度等相關參數，結果見表5，圖2。

表4 不同產地及品種楊樹花水楊苷含量Tab 4 content of Salicin in poplar from different producing areas and varieties

圖1 水楊苷含量分布Fig 1 Distribution of populin content

通過不同溶劑提取結果的比較，水、甲醇、乙醇、50%乙醇、水楊苷峰純度不夠，且前3 種溶劑提取的樣品，分離度均小于1．5，達不到要求。而50%甲醇作為提取溶劑，峰純度較好，分離度好，無雜質干擾。因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。

表5 不同提取溶劑考察結果Tab 5 Investigation results of different extraction solvents

3．1．2 提取方法的考察

3．1．2．1 超聲提取法 取楊樹花藥材粉末0．5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲30 min，取出放至室溫，用50%甲醇補足重量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。照“2．1”項下方法測定水楊苷的含量，結果見表6、圖3。

3．1．2．2 回流提取法 取楊樹花藥材粉末0．5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，回流30 min，取出放至室溫，用50%甲醇補足重量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。照“2．1”項下方法測定水楊苷的含量。結果見表6、圖4。

圖2 50%甲醇提取水楊苷HPLC 色譜圖Fig 2 50%methanol extraction Salicin HPLC chromatogram

圖3 超聲提取法水楊苷HPLC 色譜圖Fig 3 determination chromatogram of Salicin content extracted by ultrasound

圖4 回流提取法水楊苷HPLC 色譜圖Fig 4 chromatographic diagram for the determination of Salicin content extracted by reflux extraction

表6 不同提取方法水楊苷色譜峰參數比較

由上表可知，兩種提取方法，峰純度都比較好，但超聲提取法的峰面積和理論塔板數較回流提取法低。因此，選擇回流提取法作為樣品的提取方法。

3．1．3 不同取樣量的考察 分別取楊樹花藥材粉末0．5、1、2、5 g，精密稱定，分別精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，分別回流30 min，取出放至室溫，用50%甲醇補足重量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。照“2．1”項下方法測定水楊苷的光譜純度。結果表7。

表7 不同取樣量水楊苷光譜純度Tab 7 Purity of Salicin peak in different sampling quantities

由上表可知，取樣量為0．5 g 時，水楊苷光譜純度最佳。其他取樣量水楊苷色譜峰純度角大于純度閾值，純度均不純，因此，選擇取樣量為0．5 g。

3．1．4 不同提取時間的考察 取楊樹花藥材粉末0．5 g，精密稱定，分別精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，分別回流30、60、120 min，取出放至室溫，用50%甲醇補足重量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。照“2．1”項下方法測定水楊苷，結果見表8。

表8 不同提取時間水楊苷峰參數Tab 8 Effects of different extraction time on Salicin Peak parameters

由上表可知，提取時間為30 min 時，楊樹花中水楊苷含量最高，且峰分離度好。因此，選擇提取時間為30 min。

綜上，最終確定文中所述供試品的制備方法。

試驗比較了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-乙腈-水系統對水楊苷洗脫的效果，發現乙腈-水系統對水楊苷洗脫能力最強，出峰時間快，但在樣品中，分離度不好，不容易與雜質峰分開；甲醇-水系統理論塔板數太低，出峰時間晚；相比甲醇-乙腈-水系統理論塔板數較高，分離度較好。

通過不同品種楊樹花中水楊苷的測定比較發現，毛白楊中的水楊苷含量最高，其次沙蘭楊、銀白楊、中華紅葉楊，加楊、黑楊和川楊中水楊苷含量最低。原因可能與不同品種楊樹雄花序盛開掉落后形態結構有關，毛白楊雄花序花苞片和雄蕊豐滿完整，中華紅葉楊雄花序掉落后只剩下雄蕊和花干，而加楊、黑楊掉落后只剩下花干。這也間接證明楊樹花的化學成分主要集中在苞片上，因此毛白楊中水楊苷含量最高。

對于同一品種毛白楊來說，不同地域也有較大差異性，山東、陜西＞河南、山西＞河北＞北京。

對于同一產地同一品種山西來說，山西太原、市政府、農業大學三者含量基本相當，均高于森林公園的楊樹花中水楊苷含量。