同/異型發酵乳酸菌對全株玉米青貯營養成分和瘤胃降解特征的影響

李菲菲，張凡凡，王旭哲，苗芳，馬春暉

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832000)

玉米(Zea mays)青貯作為反芻家畜的基礎日糧，其營養品質佳、發酵特性好且儲藏時間長，是當今世界最為重要的反芻動物飼料源之一。當前，為提高玉米青貯的發酵特性與營養品質，國內外玉米青貯調制的常用方法主要利用各類微生物制劑，其中乳酸菌菌劑作為最為安全有效的添加劑常被應用于各類青貯飼料的發酵[1]。乳酸菌制劑是指多用于飼草青貯的一類乳酸菌添加劑，其主要目的是調節青貯原料中的微生物區系，加快發酵進程，促進乳酸的產生以降低p H值，抑制有害微生物的生長增殖從而保存青貯料的營養成分[2]。此外，青貯飼料中添加乳酸菌制劑能夠軟化青貯原料纖維，提高反芻動物的消化率，并增強青貯飼料的適口性[3]。目前，乳酸菌按照發酵類型可分為同型發酵和異型發酵乳酸菌，同型發酵乳酸菌如植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecium)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici)等[4];異型發酵乳酸菌如短乳桿菌(Lactobacillus breris)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)等[5]。其中同型發酵乳酸菌消耗能量低，能迅速降低青貯飼料的p H，然而其發酵產生的揮發性脂肪酸含量較低，不能有效抑制霉菌和酵母菌等的生長，從而造成青貯飼料的腐敗和諸多負面影響[6-8]。異型發酵乳酸菌雖然消耗底物的能量較多，但其可產生大量抑制真菌生長的乙酸，從而提高青貯飼料的有氧穩定性，并可有效防止二次發酵，通過此過程可彌補發酵造成的潛在營養損失[9-11]。研究發現，添加植物乳桿菌可顯著提高玉米青貯干物質的快速降解部分，降低全株玉米青貯料中的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，顯著增加其主要營養成分的瘤胃有效降解率。添加布氏乳桿菌可顯著降低酵母數量提高青貯飼料有氧穩定性。所以控制青貯中同/異型發酵乳酸菌的種類、比例和發酵量可能是造成其是否有影響的關鍵因素[12-14]，而對于其營養成分的影響是否會改善反芻家畜的消化率，是本研究的重點。針對此，本研究以全株玉米青貯為研究對象，探究不同發酵類型乳酸菌制劑對全株玉米青貯發酵營養成分及其瘤胃降解率的影響，旨在提高全株玉米青貯的實際營養價值，篩選改善效果較好的乳酸菌制劑，為青貯玉米飼料的優質高效生產提供指導，并為我國乳酸菌發酵菌劑的自主研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗以新疆農墾科學院選育的新飼玉10號(Zea mays cv.‘Xingsiyu NO.10’)飼用玉米為研究材料，試驗地位于新疆石河子大學牧草實驗站(N 44°20′E，88°30′，海拔420 m)，當地為典型的大陸性干旱氣候。前茬作物為棉花(Gossypium spp.)。青貯玉米種植時間為2016年4月12日-2016年8月22日(生長期為112 d)，玉米種植為穴播，密度按照寬窄行處理，種植面積為1050 m2，灌水方式采用滴灌，按照一般青貯玉米種植管理模式進行管理。在青貯玉米進入乳熟末期至蠟熟初期(玉米乳線超過2/3)時進行全株刈割，當場粉碎至2 cm左右長度。立刻進行真空袋法調制青貯(真空袋規格40 cm×50 cm)。

青貯乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)添加劑為:同型發酵LAB:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，ACCC 11016)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici，ACCC 05481)，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)。異型發酵LAB:布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri，CICC 20293)，菌種購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 試驗設計

設計4種處理，Ⅰ、同型發酵LAB處理(T處理):植物乳桿菌和戊糖片球菌復合添加，添加量為1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅱ、異型發酵LAB(Y處理):布氏乳桿菌，添加量為1×105cfu·g-1;Ⅲ、同型+異型發酵LAB(TY處理):植物乳桿菌、戊糖片球菌和布氏乳桿菌，添加量為1∶1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅳ、不加任何菌劑對照(CK處理)。各種LAB在MRS液體培養基(主要成分)中富集培養，通過平板計數后確定數量，按比例配置好后，用滅菌噴壺均勻的噴灑至待貯玉米表面(CK處理噴灑等量的去離子水)。噴灑完畢后立刻進行青貯。青貯共調制16袋(每個處理4袋)，每袋2 kg，實驗室環境(23～30℃)下發酵60 d。在第60天時開袋，從各青貯樣品中隨機挑選3袋測定各處理的營養成分及其反芻動物瘤胃消化率。

1.3 指標分析方法

營養成分主要測定干物質(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗灰分(crude ash，Ash)和淀粉(starch，Sta)。各指標均按照國標進行測定[15-18]，其中采用重量法測定DM，采用凱氏定氮法測定CP，采用蒽酮-硫酸比色法測定WSC，采用范氏(Van Soest)洗滌纖維法測定NDF和ADF，采用索氏浸提法(乙醚浸出法)測定EE，采用灰化法測定Ash，采用酶水解法測定Sta。

采用瘤胃瘺管尼龍袋法分析玉米青貯營養成分瘤胃消化率[15]。選用3只體重體型相似[(52±2.5)kg]生長狀況良好的哈薩克羊，安裝永久性瘤胃瘺管。安裝瘺管后正常飼喂1個月，期間檢查安裝瘺管羊的適應情況。試驗前采用青貯玉米飼料預飼一周，每只羊每天定量飼喂200 g精料(由天康公司提供:精料成分為玉米51%、麩皮24%、豆粕18%、尿素1.5%、食鹽1%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2%)，青貯玉米1.8 kg，自由飲水。試驗開始后將各處理樣品再次干燥(65℃)至恒定過篩(69μm)，準確稱取3 g樣品(±0.01 g)放入尼龍袋中(尺寸6 cm×9 cm，孔徑40～50μm)，填裝后用尼龍線扎口綁在鐵鏈上。于晨飼前(8:00)進行投放，共設置5個時間點(12、24、36、48、72 h)，到相應時間后將尼龍袋取出迅速洗凈測定DM、NDF、ADF和有機物(organic matter，OM)含量，OM含量為:OM%=1-Ash%(即:有機物含量=1-無機物含量)。

1.4 數據分析

青貯玉米瘤胃降解率計算方法為(1)式[19]，降解特征參數計算為(2、3)式[20]:

式中:Dx為待測青貯玉米某成分的瘤胃降解率(%);Ma為待測青貯料青貯玉米某成分含量(g);Mb為過瘤胃殘留物中某成分含量(g);Dp為青貯玉米中某成分在瘤胃內停留時間t(h)的瘤胃降解效率，A為快速降解部分(rapid degradation，%)，B為慢速降解部分(slow degradation，%)，A+B為潛在降解部分(potential degradation，%)，C為慢速降解部分的降解速率(B degradation rate，%·h-1)，ED為某成分在瘤胃內的有效降解率(effective degradation rate)，k為粗飼料瘤胃外流速率常數(%·h-1)，本研究k值取4.5%·h-1。采用Matlab軟件進行偏最小二乘計算，求得各相關參數。

利用公式(1～3)折算成對應指標降解率(degradation)，即干物質降解率(dry matter degradation，DMD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradation，NDFD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradation，ADFD)、有機物降解率(organic matter degradation，OMD)。采用Excel 2007軟件進行所有數據的初步整理，采用SPSS 22.0軟件進行數據的F檢驗，當通過F檢驗后進行單因素(One-way ANOVA)和雙因素(Two-way ANOVA)方差分析，通過單因素方差分析計算不同處理間差異性，雙因素方差分析計算發酵60 d和處理兩個因素及其交互作用影響的顯著性，多重比較方法均采用Duncan法。采用隸屬函數評價法評價出最佳處理[21]，具體公式為:

式中:X為樣品各指標測定值;UX(+)為各指標呈正相關隸屬函數值;UX(-)為各指標呈負相關隸屬函數值。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌處理對玉米青貯各營養成分含量的影響

如表1所示，全株玉米青貯原料DM含量為40.36%，CP含量為8.26%，Sta含量為29.83%，NDF含量為47.98%，ADF含量為31.32%，WSC含量為22.01%，Ash含量為9.26%，EE含量為7.58%。青貯發酵60 d時，各處理營養成分與青貯原料間存在一定差異，其中僅Ash和EE略高于青貯原料，其余營養指標均低于青貯原料。各處理間在營養指標上有顯著差異(P＜0.05)，其中DM含量按高低排序為Y處理＞T、TY處理＞CK處理(P＜0.001)，CP和Sta含量各試驗處理均極顯著高于CK處理(P＜0.01)，NDF含量按優劣排序為Y處理＞T處理＞TY處理＞CK處理(P＜0.001)，ADF含量按優劣排序為Y處理＞TY處理＞T處理＞CK處理(P＜0.001)，WSC和EE含量按高低排序均為Y處理＞TY處理＞T處理＞CK處理(P＜0.001)，Ash含量按高低排序為CK處理＞T處理＞Y處理(P=0.009)，而T、Y處理與TY處理間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 不同處理對玉米青貯營養成分的影響Table 1 Effects of different treatments on nutritional quality of plant corn silage

2.2 不同乳酸菌處理對瘤胃降解率的影響

如表2所示，瘤胃中12 h時，Y處理DMD、NDFD和OMD最高(P＜0.05)，ADFD最高為CK和T處理，其二者之間差異不顯著(P＞0.05)，T和Y處理間差異也不顯著(P＞0.05)。瘤胃中24 h時，DMD最高的為CK和T處理，二者顯著高于其余處理(P＜0.05)，NDFD和OMD最高的均為Y處理(P＜0.05)，ADFD最高的為Y處理，其顯著高于CK和T處理(P＜0.05)，但較TY處理差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃中36 h時，DMD最高的為T和Y處理，二者顯著高于其他處理(P＜0.05)，NDFD、ADFD和OMD最高的均為Y處理，其顯著高于其余處理(P＜0.05)。瘤胃中48 h時，各指標最高的均為Y處理，其顯著高于其余各個處理(P＜0.05)，僅ADFD中Y和TY處理差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃中72 h時，各指標最高的均為Y處理，其顯著高于其余各個處理(P＜0.05)。雙因素方差分析結果表明，處理(M)、時間(H)以及M和H的交互作用(M×H)對各指標均有極顯著的影響(P＜0.01)。

2.3 不同乳酸菌處理對玉米青貯各營養成分瘤胃降解參數的影響

通過對玉米青貯各營養成分(DM、NDF、ADF、OM)在瘤胃中的降解模型特征參數分析，結果表明(表3)，各營養成分基本含量同開窖60 d時的情況(表1)，其中DM降解參數中，CK和Y處理快速降解部分(A)顯著高于T和TY處理(P=0.021);CK處理慢速降解部分(B)和潛在降解部分(A+B)顯著高于其余各處理(P＜0.05);B的降解速率(C)最高的為T處理，其顯著高于其余各處理(P＜0.05)，CK處理顯著高于TY處理(P＜0.05)，Y處理與CK和TY處理差異不顯著(P＞0.05);DM有效降解率，T和Y處理顯著高于CK和TY處理(P=0.007)。NDF降解參數中，T和Y處理下A顯著高于CK和TY處理(P=0.027);各處理下B和A+B按大小排序為，TY處理＞Y處理＞T處理＞CK處理(P＜0.05);各處理之間C的差異不顯著(P=0.227);NDF有效降解率，T和Y處理顯著高于CK和TY處理(P=0.009)。ADF降解參數中，T和Y處理下A顯著高于CK和TY處理(P=0.006);各處理B、A+B、C和ADF有效降解率之間差異均不顯著(P＞0.05)。OM降解參數中，Y處理A顯著高于其余處理(P＜0.05)，CK處理A顯著高于T處理(P＜0.05)，而TY處理下A較CK和T處理差異均不顯著(P＞0.05);CK和Y處理下B顯著高于T處理(P＜0.05)，但較TY處理相比差異不顯著(P＞0.05)，且T和TY處理間差異不顯著(P＞0.05);A+B按大小排序為CK和Y處理＞T和TY處理(P=0.027);Y處理C與T處理相比差異不顯著(P＞0.05)，但顯著高于CK和TY處理(P＜0.05)，T處理與CK和TY處理間差異均不顯著(P＞0.05);OM有效降解率，Y處理顯著高于其余各處理(P=0.003)。

表2 不同處理對玉米青貯瘤胃降解率的影響Table 2 Effects of different treatments on rumen regeneration of plant corn silage(%)

表3 不同處理玉米青貯瘤胃中各指標的降解率和降解參數Table 3 The digestibility and digestibility coefficients of corn silage with different treatments

2.4 不同乳酸菌處理玉米青貯各指標的綜合價值評價

由于各處理在不同指標上表現均不相同，而以任何一個單一指標評價最佳發酵處理均是不全面的[21]。因此，對12項營養成分和瘤胃降解率特征指標進行隸屬函數分析，其中NDF、ADF為負向指標(即含量越高質量越差)，其余均為正向指標。隸屬函數值綜合價值評價中，平均值越大綜合價值越高，各處理綜合價值按高低排序為:Y處理(0.76)＞T處理(0.62)＞TY處理(0.37)＞CK處理(0.16)(表4)。

3 討論

3.1 同/異質型乳酸菌添加對玉米青貯營養指標的影響

青貯的營養成分是評價青貯飼料最為直接的指標。其中DM含量作為青貯玉米底物營養成分的基礎尤為重要。以往研究表明，青貯玉米中添加乳酸菌菌劑均可顯著提高DM含量[4]，且接種布氏乳桿菌在提高不帶穗玉米秸稈青貯的DM含量方面最為有效[12]，本研究中加入各種乳酸菌處理的DM含量也顯著高于不加菌劑處理，且其中添加布氏乳桿菌(Y處理)提高DM含量最為顯著，這證實了以往研究論點。開窖時CP含量較發酵前相比均有所下降，而添加乳酸菌處理均顯著高于不加菌劑處理，其原因主要為青貯發酵過程是多種微生物參與的體系，在各類微生物(好氧/厭氧)的共同作用下，底物中蛋白物質被大量消耗，轉化成氨態氮和胺類物質;但由于外源添加的乳酸菌在發酵過程中占主導地位，其一方面降低了蛋白向氨態氮轉化的效率(即降低氨態氮含量)[8-9];另一方面，其繁殖產生的菌體蛋白可增加青貯體系的蛋白含量[22]。此外，有學者在不同干物質含量的苜蓿(Medicago sativa)青貯中接種乳酸菌也得到了相同的結論[23]。添加各乳酸菌處理均提高青貯體系Sta含量，其說明乳酸菌有利于提高青貯體系Sta含量，同時也佐證了添加不同發酵類型乳酸菌青貯可顯著提高奶牛奶產量(Sta含量與奶產量呈正相關)[4，22]。有學者在大麥(Hordeum vulgare)、桑葉(Morus alba)和全株青貯玉米中添加不同發酵類型乳酸菌，結果表明NDF和ADF含量均顯著下降[23-26]，本研究得到相同結論。另外本研究表明布氏乳桿菌在降低NDF和ADF含量方面效果最為顯著，原因可能是布氏乳桿菌的繁殖產生阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，FE)，其可水解木質素和半纖維素之間的阿魏酸酯鍵，破壞纖維結構，從而降低纖維的含量，并在一定程度上改善飼料的纖維可消化性[27]。對于本研究中Ash和EE含量發酵前后的變化規律，與苗芳等[21]得到的試驗結果相似，而產生這一規律的原因目前還尚未明確[28]，有待繼續探索。

表4 各處理全株玉米青貯隸屬函數分析及綜合價值排序Table 4 Analysis and comprehensive value rank withdifferent treatments on the membership function of all silage corn

3.2 同/異質型乳酸菌添加對綿羊瘤胃降解率的影響

反芻動物對粗纖維的消化利用主要是通過瘤胃中微生物的降解來進行的，測定NDF和ADF的表觀消化率，能在一定程度上反映出瘤胃微生物對纖維的消化降解情況。有研究發現豌豆(Pisum sativum)和小麥(Triticum aestivum)青貯中添加布氏乳桿菌提高了瘤胃氮降解營養成分的能力和NDFD，但不顯著影響ADFD和DMD[29-30]，本研究得到相似結論，NDFD隨瘤胃停留時間的延長(12～72 h)逐漸升高，此外本研究中DMD、OMD也隨瘤胃停留時間的延長逐漸升高，這與Aksu等[30]研究結果相同。另有研究對稻貯中添加微生態制劑(乳酸菌)，其較不添加相比DMD、ADFD和NDFD隨之升高[31]，本研究也得到了相同的結果。所以對于青貯底物(飼草)、乳酸菌(不同發酵類型)接種劑量以及發酵時間的不同均可導致瘤胃降解率產生很大變化。另外，有研究表明在不同菜渣青貯中添加植物乳桿菌后，僅有部分菜渣體外消化率有所升高[32]，其在證實了上述猜測的同時，也表明并不是所有作物或農副產品均適宜青貯發酵，控制發酵底物的含水量和營養成分比例可能是導致出現不同結果的主要原因。此外，微生物尤其是乳酸菌在發酵體系中的作用規律不容忽視，在青貯飼料發酵初期片球菌起著非常重要的作用，植物原料在收獲制作成青貯飼料后，最先進行發酵的是糞鏈球菌和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，接著被更耐酸的菌株，如植物乳桿菌、短乳桿菌、布氏乳桿菌等取代[33]。本試驗中ADFD和NDFD均顯著增加，另一個主要的方面是利用乳酸菌制劑處理后，青貯過程中的乳酸菌數量顯著增加，發酵速度加快，產生大量的乳酸，降低青貯料的p H值，進而抑制有害微生物的活性，提高其營養成分在瘤胃內的有效降解率，使得處理后的全株玉米青貯向瘤胃微生物提供更多可溶性的營養成分[34]。瘤胃內環境作為一個相對繁瑣的微生物系統，其中多種微生物和因素發揮著重要作用，需要繼續深入研究來更好地掌握乳酸菌添加劑對反芻動物的益生菌效應[22]。

4 結論

本研究得到以下結論:1)玉米青貯中單獨添加布氏乳桿菌可顯著增加開窖60 d時DM、CP、Sta、NDF、ADF、WSC和EE含量。2)DMD、ADFD、NDFD、OMD隨瘤胃降解時間的延長顯著提高，瘤胃降解時間、不同試驗處理以及其交互作用均極顯著影響各指標變化。添加布氏乳桿菌顯著提高DM和OM有效降解率，植物乳桿菌、戊糖片球菌和布氏乳桿菌復合添加顯著提高NDF有效降解率。3)結合營養成分和有效降解率等12項參數指標綜合評價各試驗處理，最佳添加處理為單獨添加布氏乳桿菌，添加量為1×105cfu·g-1。