腺苷A2a受體激動劑(CGS21680)對幼齡大鼠體外循環肝臟損傷的保護作用

儲培逸，葛建軍，左 逸，孔 祥，趙智偉，周正春

現如今心臟手術的成功離不開體外循環技術(cardiopulmonary bypass,CPB)，該技術對改善患者預后有著十分重要的作用[1]。雖然現在越來越多的患者接受心臟手術，但是CPB這種技術由于其對患者全身是一種非常大的刺激，容易給患者帶來多處組織損傷。之前的研究大多更關注心臟、肺及腎臟等器官，而對肝臟的關注不夠，大約10%的心臟手術患者，往往存在著術后肝臟損傷。因此，尋找到一種可以減輕CPB對于肝臟所帶來的損害是十分有必要的。

肝臟損傷的機制包含全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)與氧化應激反應。SIRS是由一系列復雜的炎癥反應所引起的，如巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和血小板的激活，以及細胞因子和白三烯的增加[2]。研究[3]表明，嘌呤核苷腺苷可以調節多種炎癥反應。其中G蛋白偶聯受體，包括A1、A2a、A2b和A3，可以顯著地發揮腺苷的細胞活性[4-5]。正是由于A2a受體的存在，抗炎作用十分突出[6]。之前有研究[7]表明，腺苷A2a受體激動劑的激活可以減輕CPB后的肺損傷，但對減輕肝損傷的報道卻極少。該研究通過構建幼齡大鼠的CPB模型，探討腺苷A2a受體激動劑(CGS21680)是否可以減輕幼齡大鼠體外循環帶來的肝損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料健康清潔級幼齡SD大鼠36只，5～6周齡，體質量(213±10.5)g，在相對清潔及恒溫的環境下，予以標準飼料飼養。腺苷A2a受體激動劑CGS21680購自英國Tocris公司。

1.2 方法

1.2.1分組 將36只健康幼齡大鼠隨機分為3組：假手術組、CPB組及CGS21680組，每組12只，幼齡大鼠術前12 h禁食及6 h禁水后，假手術組不進行CPB。CGS21680組在轉流前往貯血器中加入CGS21680(120 μg/kg)。

1.2.2幼齡大鼠CPB模型的建立 本研究采用了Dong et al[8]開發的成年大鼠CPB模型，經腹腔內麻醉后氣管切開插管接呼吸機。左側股動脈穿刺24 G靜脈留置針用于監測平均動脈壓(MAP)及血氣。經右側頸靜脈置入20 G多孔套管至右心房以引流靜脈血入貯血器，再通過微量蠕動泵以及膜式肺氧合器，從右側股動脈灌注。通過右側頸靜脈予以幼齡大鼠全身肝素化。CPB預充液采用的是含血預充，共20 ml。轉流開始后約10 min流量逐漸加大到每分鐘100 ml/kg，并維持此轉速1 h后停機，嚴密觀察幼齡大鼠的生命體征變化。

1.3 標本收集分別于肝素化后轉流前(T0)、CPB 30 min(T1)、轉流結束時(T2)和術后1 h(T3)從左股動脈采集血樣，高速離心機5 000 r/min離心10 min后，取血漿保存于-80 ℃冰箱留待檢測各項指標。術后1 h后處死幼齡大鼠，打開胸腔，分離肝臟并分成兩部分，一部分于-80 ℃冰箱保存進行相關炎癥因子等指標檢測，剩余的肝臟切片后，用4%甲醛固定，光學顯微鏡觀察形態學變化。

1.4 指標檢測

1.4.1炎癥因子的檢測 ELISA法：用根據制造商的指導為幼齡大鼠制備的酶聯免疫吸附測定試劑盒測定血液中白細胞介素-1β(interleukinin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukinin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等濃度，其中IL-1β濃度以ng/L表示，IL-6和TNF-α濃度則以μg/L表示。

1.4.2肝功能指標的檢測 通過自動分析器(日本日立公司)檢測幼齡大鼠的血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspertate transaminase，AST)水平，濃度均以U/L表示。

1.4.3抗氧化指標谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)檢測 根據試劑盒(南京建成生物制品)說明書指示測定GSH-PX活性，活性以酶活力單位U表示。

1.5 肝臟組織HE染色肝臟組織標本石蠟包埋后，用HE染色組織切片并在光學顯微鏡下觀察，并由有經驗且對實驗不知情的病理學專家進行評估。

2 結果

2.1 各組幼齡大鼠術后一般情況36只幼齡大鼠均順利建立CPB模型，術后1 h全部存活，酸堿度(potential of hydrogen，pH)、 MAP、紅細胞比容(hematocrit value，HCT)、PO2、PCO2、iCa等數據在整個實驗中的各個時間點都很穩定，所有數據符合臨床且可被接受。見表1。

2.2 各組幼齡大鼠血清ALT、AST水平ALT及AST水平的變化在各組手術開始未發現差異，術中的時候，CPB組ALT及AST水平先降低后上升，而假手術組依舊保持低水平。而隨著CGS21680組中的藥物加入，雖然并不能改變ALT及AST的變化趨勢，但是相比較于CPB組，AST及ALT的水平有明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.3 各組幼齡大鼠血清中炎癥因子指標各時間點的變化各組幼齡大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平在T0時無明顯差異，而隨著手術的開始，T1～T3各時間點，CPB組中血清的炎癥指標水平相比較于假手術組是顯著上升的(P<0.05)，而CGS21680組中相對于CPB組的炎癥指標卻有顯著下降(P<0.05)。見表2、3。

2.4 各組幼齡大鼠肝臟炎癥因子指標的變化水平CPB組幼齡大鼠肝臟組織的炎癥指標顯著上升，IL-1β、IL-6和TNF-α顯著高于假手術組(P<0.05)，而CGS21680組的各項炎癥指標顯著低于CPB組(P<0.05)。見表4。

2.5 各組幼齡大鼠血清中抗氧化指標的變化水平

表1 實驗前后幼齡大鼠的基本情況

表2 各組幼齡大鼠血清中IL-1β表達水平

與CPB組比較：*P<0.05；與CGS21680組比較：#P<0.05; 與假手術組比較：▽P<0.05

表3 各組幼齡大鼠血清中TNF-α表達水平

與CPB組比較：*P<0.05；與CGS21680組比較：#P<0.05; 與假手術組比較：▽P<0.05

表4 各組幼齡大鼠肝臟中的炎癥因子表達水平

與CGS21680組比較：*P<0.05；與假手術組比較：#P<0.05

圖1 各組幼齡大鼠肝酶表達水平

如表5所示，各組幼齡大鼠血清中GSH-PX水平在T0時無明顯差異，而T1～T3各時間點，CPB組與假手術組則有著顯著差異(P<0.05)。在CGS21680組中，幼齡大鼠的GSH-PX水平顯著高于CPB組(P<0.05)。

表5 各組幼齡大鼠血清中GSH-PX表達水平

與CPB組比較：*P<0.05；與假手術組比較：#P<0.05

2.6 各組幼齡大鼠肝組織HE染色情況假手術組肝索排列整齊，未見腫脹，而CPB組出現肝細胞溶解和壞死，組織紊亂，部分肝細胞水腫和少量膽紅素積聚。CGS21680組肝細胞裂解和壞死要輕于CPB組，但仍存在少量的肝細胞水腫和組織間隙。見圖2。

3 討論

心臟外科的CPB手術對于人及動物來說，術后均會產生嚴重的創傷，目前研究普遍認為主要是系統性炎癥反應綜合征，極易產生炎癥等反應，這些反應大多數來說都是由于手術本身創傷、轉流過程中血液與管道接觸、血液細胞的破壞以及全身多處臟器缺血再灌注損傷，而產生炎癥因子進入循環中導致的。在過去的三十年中，很多研究關注CPB后患者的心臟、肺臟及腎臟等器官損傷及保護[9]。但現在越來越多的肝臟損傷對患者治愈率及死亡率的影響逐漸顯現[10]，所以臨床醫師越來越多的關注術后肝臟損傷，尋找合適的藥物來減輕CPB帶來的巨大創傷一直是研究的方向。但出于倫理方面的考慮和其他影響因素，所以未能提供組織供以研究。因此，穩定的幼齡大鼠CPB模型是必需的。

圖2 3組肝組織病理圖 HE×200

本研究通過建立幼齡大鼠的CPB的模型，來觀察和對比CPB組與假手術組的組織病理學及生化指標的變化，可以看出CPB后幼齡大鼠出現了肝臟損傷。而肝臟損傷會直接導致血清中的轉氨酶上升，轉氨酶的上升主要是指AST和ALT的上升，這可能是由于CPB的轉流時間過長致使肝臟出現淤血，從而使細胞膜及線粒體受損而造成的變化。

通過檢測炎癥指標的變化可以看出CPB后，幼齡大鼠出現了肝臟損傷，且CPB組的幼齡大鼠的炎癥指標水平明顯高于假手術組，所以IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥指標的確起到了損傷肝臟的作用，這些作用可能是以補體和凝血系統的激活、內皮細胞功能障礙、血小板的活化及細胞因子產生等刺激方式觸發的[11]。

據報道，腺苷具有顯著的抗炎能力[12]。由于腺苷A2a受體亞型是炎癥細胞中表達的主要腺苷受體，意味著腺苷的大部分抗炎作用可能依賴于A2a受體。而A2a受體也被認為存在于所有炎癥細胞中，包括內皮細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞[13]。所以CGS21680可以顯著減少CPB后幼齡大鼠體內的炎癥指標水平，為了進一步探討腺苷受體激動劑對幼齡大鼠肝臟保護的作用，CGS21680組中幼齡大鼠在接受CGS21680藥物的干預后炎癥因子的水平有著十分顯著的下降，表明經過CPB后幼齡大鼠體內的大量炎癥反應的減少可能的確是由于腺苷A2a受體激動劑CGS21680的存在，這些結果證明藥物CGS21680可以通過抗炎作用來減輕幼齡大鼠CPB后所引起的肝臟損傷。

GSH-PX可以通過催化GSH成為氧化型谷胱甘肽(GSSG)參與抗氧化損傷的細胞防御。一些研究[14]表明，各種刺激引起的組織損傷與GSH消耗有關。上述結果發現CPB組中GSH-PX顯著低于假手術組，而CGS21680組中GSH-PX相對于CPB組來說減少卻并不明顯。所以說GSH-PX參與了抗氧化防御。因此，結果表明腺苷受體的激活可以抑制氧化應激從而保護幼齡大鼠CPB所導致的肝臟損傷。

綜上所述，腺苷受體激動劑CGS21680的確能夠顯著地減輕幼齡大鼠CPB所引起的肝臟損傷，這種結果可能主要是其抗炎與抗氧化應激作用所帶來的[15]。因此，CGS21680藥物可以被認為是保護肝臟損傷的潛在治療藥物，但該藥物對于肝臟保護的具體機制及到臨床使用等問題仍需進一步研究。