GA結合蛋白亞單位a在結腸癌中的表達及臨床意義

姜洪勝，孫建華，吳泉峰，黃國全

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全球癌癥發(fā)病率的近10%，且病死率高[1-2]。雖然結腸癌的治療手段取得一定的進展，但是由于難以早期診斷而錯過最佳治療時間，結腸癌患者生存率仍然很低。因此，迫切需要尋求新的可靠的生物標志物用于評估結腸癌的預后。GA結合蛋白亞單位a(GA binding protein transcription factor alpha subunit，GABPA)是GA結合蛋白a鏈，是由GABPA基因編碼的三個亞單位之一，其作為一個轉錄激活因子，發(fā)揮著DNA結合的功能，并且它還參與了細胞色素氧化酶的活化和線粒體功能的細胞核調控機制[3-4]。本研究通過檢測結腸癌患者與相應的癌旁組織的GABPA表達情況，分析其與患者臨床病理特征及預后的關系，探討GABPA在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2007年1月—2011年12月湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術切除的結腸癌患者174例癌組織及對應癌旁組織標本，每例均有完整的臨床背景資料和病理組織學切片診斷支持，所有病例均經(jīng)至少2位病理學專家確診為結腸癌。所有標本均為手術切除后獲取的石蠟標本，所有病例在術前均未接受過放療、化療、免疫治療和分子靶向治療。

1.2 GABPA檢測方法 按照北京中杉金橋公司試劑盒的說明書進行SP二步法免疫組化染色，具體步驟如下: 石蠟切片放入60℃ 烤箱內(nèi)烘烤1 h;切片常規(guī)二甲苯溶液脫蠟、酒精梯度脫水; 95℃以上用EDTA抗原修復25 min，自然冷卻至室溫; 3% H2O2室溫靜置10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，每次5 min;甩干PBS，滴加GABPA兔抗人單克隆抗體(購自Abcam公司)，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜; PBS 清洗3次，每次3 min;滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加DAB顯色液(購自武漢博士德生物工程有限公司)，鏡下掌握顯色程度;自來水充分沖洗;蘇木素復染1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 結果判定 每張石蠟切片在10×40倍光學顯微鏡下隨機取5個視野，GABPA蛋白陽性表達為棕黃或棕褐色染色，定位于胞漿。按以下標準評分: 0分，不著色或僅有弱著色；1分，淺棕色；2分，深棕色。計算每個視野下的陽性細胞數(shù)，著色細胞占細胞總數(shù)<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。應用染色強度評分值與陽性細胞百分數(shù)評分值相加，對GABPA蛋白的表達分為：低表達0～4分，高表達5～6分。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，采用卡方檢驗分析GABPA表達水平高低與臨床病理特征的相關性；采用Kaplan-Meier分析評估GABPA蛋白表達對結腸癌患者生存率的影響；采用Cox回歸(比例風險模型)對預后因素進行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GABPA蛋白在結腸癌組織及癌旁組織的表達 運用免疫組化檢測174例結腸癌組織和對應的癌旁正常組織中GABPA蛋白的表達情況。GABPA陽性染色為棕黃色或深褐色，其主要表達定位于細胞漿中(圖1見封3)。免疫組化檢測結果顯示，癌組織GABPA的陽性表達為20.11%(35/174)，顯著低于癌旁組織55.17%(96/174)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.23,P<0.05)。

2.2 GABPA蛋白表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系 為研究GABPA的表達水平與結腸癌患者臨床病理特征之間是否相關，將結腸癌組織中GABPA表達量取平均值分為低表達組84例和高表達組90例。GABPA蛋白在結腸癌中的低表達與淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期相關(P<0.05),而GABPA蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、血管侵潤和分化程度無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

2.3 GABPA表達水平與臨床預后之間的關系 隨訪8年，分析了結腸癌患者的臨床信息。174例結腸癌患者中死亡92例(GABPA低表達組56例，GABPA高表達組36例)。利用Kaplan-Meier分析結腸癌患者中GABPA表達水平與臨床預后之間的關聯(lián)。檢查結果發(fā)現(xiàn)，與GABPA高表達的患者相比，GABPA低表達的患者總生存的平均天數(shù)更短(χ2=7.15,P= 0.006)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析結腸癌患者GABPA表達水平與臨床預后之間的關聯(lián)

2.4 采用Cox回歸(比例風險模型)對預后因素進行分析 單變量Cox比例風險回歸模型分析顯示，腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、分化程度、TNM分期、血清GABPA表達水平與結直腸癌患者總生存率相關(P<0.05)。多變量Cox回歸分析顯示，GABPA低表達是結直腸癌患者的預后的獨立危險因素(HR=2.813，95%CI1.035～4.911，P=0.013)，見表2。

3 討 論

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關死亡的第三大原因。每年全世界有超過60萬人因結腸癌死亡[5-7]。盡管結腸癌在治療方面取得了巨大進展，但由于其易轉移，結腸癌的預后仍然很差[2]。因此，尋找有效可行的評估結腸癌預后的分子標志物極其重要。

GABPA在胚胎發(fā)育、先天性免疫、獲得性免疫、骨髓和造血干細胞分化中發(fā)揮作用[8-12]。研究表明,GABPA在膀胱癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤中可以選擇性結合于突變的端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子產(chǎn)生的ETS轉錄因子結構域，從而激活TERT表達，促進腫瘤進展[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，GABPA可通過調控激酶互作的序列域(KIS)的表達抑制血管平滑肌細胞的遷移[15]。因此，GABPA對癌細胞遷移和侵襲的作用可能具有組織特異性，并且可能涉及不同細胞中的不同信號傳導途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，GABPA蛋白在結腸癌組織中顯著低表達，而在癌旁組織中高表達，提示GABPA在結直腸中可能作為抑癌基因參與了結腸癌的發(fā)生，這與GABPA在其他多種類型腫瘤中低表達結果相一致。GABPA蛋白的低表達與結腸癌患者淋巴結轉移和遠處轉移顯著相關，提示GABPA在結腸癌的發(fā)展中起到抑制作用。TNM分期越高，GABPA陽性表達率越低，提示GABPA在結腸癌的侵襲、轉移中有重要作用。

表1 結腸癌組織GABPA表達與臨床病理特征的相關性

表2 Cox比例風險回歸模型對預后因素進行單變量和多變量回歸分析

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GABPA在結腸癌組織中低表達與淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期密切相關，且GABPA與結腸癌患者的預后密切相關，可能是結腸癌的一項新的獨立預后因子。因此，深入研究GABPA在結腸癌中的作用機制，可為結腸癌治療提供新的治療靶點。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

姜洪勝：查找文獻，完成實驗所有部分，論文撰寫；孫建華：完成部分實驗，論文指導，吳泉峰：統(tǒng)計數(shù)據(jù)；黃國全：實驗設計，論文審核