自主跑輪運動調控MMP-2/TIMP-2穩態平衡改善去卵巢大鼠心臟重塑

任 磊，苗 杰，秦永生，王大寧，彭 朋

絕經前女性患心血管疾病的風險明顯低于同齡男性，然而女性的性別優勢在絕經后逐漸減退[1]，提示性激素對心肌代謝具有重要調節作用。除雌激素減少外，女性絕經后體重增加、肥胖等危險因素同樣增加心血管疾病發病率[2]。動物實驗及人體研究均證實[3]，雌激素減少甚至缺乏（絕經）可誘導心臟發生病理性重塑，心血管發病率（如急性心肌梗塞、心力衰竭）明顯升高。

心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在心臟生長發育、結構重塑以及功能穩態中起關鍵作用[4]。心肌ECM主要成分是膠原（I型和III型），后者由成纖維細胞產生。膠原合成與降解的動態平衡對于維持心臟正常結構與功能具有重要調節效應。心臟處于病理狀態下（如高血壓、心肌梗塞等），心臟發生重塑，表現為心肌膠原過度沉積甚至發生心肌纖維化、心臟肥大、心肌細胞凋亡，導致心臟結構和功能異常甚至引起心力衰竭[4]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅依賴性蛋白水解酶家族，其中MMP-2是最重要的一種MMPs，在大多數細胞內呈組成性表達，其作用是降解變性膠原及其他ECM蛋白[5]。此外，MMPs還受其天然抑制劑——組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的負反饋性調節，以防止ECM被過度降解[6]。因此，MMPs與TIMPs間的穩態平衡是心臟重塑的決定性因素。

規律運動是預防和治療心血管疾病的重要非藥物手段，具有經濟、安全、方便、副作用小、療效顯著等突出特點[7]。針對多種心血管疾病患者/動物模型的研究均顯示，有氧運動能夠誘導心血管系統產生良性適應，包括血壓下降、心肌細胞再生、心肌纖維化和心臟肥大減輕，從而抑制病理性心臟重塑[8]。PóSA等[9]的研究發現，有氧運動聯合熱量限制能夠顯著降低去卵巢大鼠心血管危險因素水平。業已證實，雌激素缺乏誘導MMP-2活性下調以及MMPs/TIMPs系統穩態失衡是心肌重塑的重要原因[3]，而氧化應激介導的翻譯后修飾可激活MMP-2[10-11]。由于運動對ECM代謝以及氧化應激均具有調節作用，因此推測規律體力活動能夠抑制雌激素缺乏誘導的病理性心臟重塑，其機制可能與調控MMP-2/TIMP-2穩態平衡有關。本研究旨在觀察8周自主跑輪運動對去卵巢大鼠心臟重塑的影響并探討MMP-2和TIMP-2在其間的作用機制，為絕經后女性心血管疾病的康復治療提供科學依據和有效方法。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與分組

60只8周齡雌性SPF級Wistar大鼠，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。動物分籠飼養，12/12 h明暗交替，溫度20～24℃，濕度50%～60%，自由進食水。

動物適應環境1周后依照隨機數字表法分為假手術組（n＝30）和去卵巢組（n＝30），去卵巢組大鼠行卵巢摘除術，方法為[12-13]：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（0.1 mg/kg）麻醉動物，俯臥位備皮，沿背部后正中線做1.0～1.5 cm縱型切口，暴露棕黃色卵巢組織，沿子宮角處結扎并切除卵巢，逐層縫合傷口。假手術組僅切除卵巢周圍脂肪，其他步驟同上。術后給予青霉素（0.2 mL，20 000 IU）肌注以預防感染。4周后將假手術組隨機分為假手術安靜組（sham control group，SC）和假手術運動組（sham exercise group，SE），去卵巢組分為去卵巢安靜組（ovariectomized group，OV）和去卵巢運動組（ovariectomized exercise group，OVE），每組n＝15。隨后SC和OV組動物在鼠籠內安靜飼養，SE和OVE組進行8周自主跑輪運動，即鼠籠內安裝有一直徑為26 cm、寬8 cm并能夠自由轉動的鋼質跑輪，動物可自由進行轉輪運動，不控制運動強度和時間[14-15]。干預周期選擇8周參照文獻報道[16]，即誘導心血管系統產生良性變化的最短時間。

實驗過程中由于造模失敗、意外死亡等原因，共剔除5只動物，最終樣本量n＝55，分別為SC組n＝15、SE組n＝15、OV組n＝13、OVE組n＝12。

1.2 心臟結構與功能測定

末次實驗后48 h稱量體質量，隨后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（0.1 mg/kg）麻醉動物并取仰臥位固定，胸部備皮，用高分辨率小動物超聲影像系統（Vevo 3100，加拿大VisualSonics公司）檢測心臟結構和功能，取左心室乳頭肌水平進行二維短軸掃描（M超）。檢測指標包括：左心室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter LVEDD）、左心室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.3 大鼠取材

超聲檢測后每組取4只動物利用Langendorff灌流裝置建立離體心臟缺血/再灌注模型（見1.8）。其余大鼠處死后取出心臟并稱重（心臟質量），分離左心室并稱重（左心室質量），分別計算與體質量的比值作為心臟質量指數（heart mass index，HMI）和左心室質量指數（left ventricular mass index，LVMI）。在左心室最大橫徑處橫切將其分為兩部分，一部分利用Masson染色進行組織病理學觀察，另一部分投入液氮中并迅速轉入-80℃低溫冰箱凍存待測。

1.4 心肌病理組織學觀察

將心肌組織用10%甲醛溶液固定，經脫水、透明、包埋和切片（5 μm）后利用Masson染色制作組織切片，每張切片隨機選取5個視野，用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics公司）測量膠原面積，用膠原面積與所測視野面積的比值作為膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）以表示心肌纖維化程度。

1.5 心肌MMP-2和TIMP-2蛋白表達量檢測

利用Western Blot法檢測蛋白表達量。心肌組織勻漿后，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白經7.5%SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜。64 kDa MMP-2、72 kDa MMP-2和TIMP-2一抗4℃靜置過夜，二抗37℃孵育2 h，充分洗滌后，使用ECL發光成像，利用凝膠成像系統（ChemiDoc XRS，美國BIO-RAD公司）拍攝并掃描各條帶灰度值。將每個條帶與相應樣品的β-actin條帶灰度值進行比較，以各組與SC組的比值作為蛋白相對表達量。

1.6 心肌谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量檢測

心肌組織勻漿后（勻漿液成分：0.25 M蔗糖、20 mM Tris、1 mM二硫蘇糖醇），4℃、15 000 g離心30 min，取上清并加入0.1 M CaCl2、0.25 M蔗糖、20 mM Tris和1 mM二硫蘇糖醇后孵育30 min，20 000 g離心60 min，取上清按照GSH試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）操作說明，利用紫外分光光度計（U-3010，日本日立公司）以比色法于420 nm波長處測定OD值，根據標準品計算心肌GSH含量（單位：mmol/mg蛋白）。

1.7 心肌I型膠原（type I collagen，Col-I）和3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）含量檢測

取適量心肌組織于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中勻漿，4℃、3 000 g離心20 min，按照相應試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明進行操作，利用利用紫外分光光度計（U-3010，日本日立公司）以比色法于450 nm波長處測定OD值，參照標準品計算心肌Col-I（單位為：pg/mg蛋白）和3-NT含量（單位為：pmol/mg蛋白）。

1.8 大鼠離體缺血-再灌注模型制備與心肌梗死面積檢測

按10 ml/kg腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥固定，開胸后將心臟置于持續通入95%O2和5%CO2混合氣體的4℃預冷的肝素化K-H液中，將主動脈連接至Langendorff離體心臟灌流系統（南京美易科技有限公司）末端，灌流條件保持37℃恒溫、75 mmHg恒壓。心臟灌流平衡10 min后，停止氧供和灌注液，使心臟缺血30 min后再灌注60 min。

灌流完成后收集心臟標本置于-80℃低溫冰箱凍存20 min后取出，迅速沿心尖部至心底部橫切取1～2 mm厚度心肌組織，置于10%甲醛溶液固定并利用Masson染色制作病理切片，方法同1.4。每張切片隨機選取5個視野，用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics公司）檢測心肌梗死面積，根據以下公式計算心肌梗死面積百分比：心肌梗死面積百分比=心肌梗死面積÷所測視野心肌總面積×100%。

1.9 統計學分析

使用SPSS20.0統計軟件進行數據分析處理。所有數據以“均數±標準差”表示，組間比較使用單因素方差分析，多重比較使用LSD檢驗。顯著性水平定為P＜0.05。

2 結果

2.1 體質量與心臟質量的變化

與SC組比較，OV和OVE組體質量增加（P＜0.05），SE組、OV組和OVE組心臟和左心室質量、HMI和LVMI均升高（P＜0.05）；與OV組比較，OVE組體質量和心臟質量下降（P＜0.05），HMI、左心室質量以及LVMI無顯著性差異（P＞0.05）（見表1）。

表1 體質量與心臟質量的變化Table 1 Body Mass and Cardiac Mass

2.2 心臟結構與功能的變化

與SC組比較，SE組LVEDD、LVWT升高（P＜0.05），OV組LVWT升高（P＜0.05），LVEDD和LVEF下降（P＜0.05），OVE組LVWT升高（P＜0.05），LVEF下降（P＜0.05）；與OV組比較，OVE組LVEDD和LVEF升高（P＜0.05）（見表2）。

表2 心臟結構與功能的變化Table2 Cardiac Structure and Function

2.3 心肌病理組織學觀察以及CVF和Col-I含量的變化

心臟組織病理學觀察見圖1，各組CVF的變化見圖2，Col-I含量的變化見圖3。結果顯示：心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。SC和SE組僅含有極少量膠原纖維；OV和OVE組膠原含量明顯增多，CVF和Col-I含量均高于SC組（P＜0.05）；OVE組較OV組膠原纖維顯著減少，CVF和Col-I含量降低（P＜0.05）。

圖1 心肌病理組織學觀察（Masson染色，×400）Figure1 Histopathology of Myocardium（Masson staining，×400）

圖2 各組CVF的變化Figure 2 CVF in Each Group

圖3 各組Col-I含量的變化Figure 3 Col-I Content in Each Group

2.4 心肌MMP-2和TIMP-2蛋白表達量的變化

72 kDa MMP-2活性在各組均無顯著性差異（P＞0.05）。與SC組比較，OV組64 kDa MMP-2活性、TIMP-2含量以及64 kDa MMP-2/TIMP-2比值均下降（P＜0.05）；與OV組比較，OVE組64 kDa MMP-2活性、TIMP-2含量以及64 kDa MMP-2/TIMP-2比值升高（P＜0.05）（見圖4～6）。

圖4 各組MMP-2蛋白表達量的變化Figure4 MMP-2 Protein Expression in Each Group

圖5 各組TIMP-2含量的變化Figure5 TIMP-2 Content in Each Group

圖6 各組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值的變化Figure6 64 kDa MMP-2/TIMP-2 Ratio in Each Group

2.5 心肌3-NT和GSH含量的變化

與SC組比較，OV組3-NT和GSH含量均下降（P＜0.05）；與OV組比較，OVE組GSH含量升高（P＜0.05），3-NT含量無顯著性變化（P＞0.05）（見圖7～8）。

圖7 各組心肌3-NT含量的變化Figure7 Myocardial 3-NT Content in Each Group

圖8 各組心肌GSH含量的變化Figure8 Myocardial GSH Content in Each Group

2.6 離體缺血-再灌注時心肌梗死面積的變化

經Masson染色后，存活心肌被染成紅色，梗死心肌呈現藍綠色（見圖9）。與SC組比較，SE組心肌梗死面積百分比下降（P＜0.05），OV組心肌梗死面積百分比升高（P＜0.05）；與OV組比較，OVE組心肌梗死面積百分比下降（P＜0.05）（見圖10）。

圖9 離體缺血-再灌注時心肌梗死區示意圖（Masson染色，×400）Figure9 Myocardial Infarct Zone during Isolated Ischemia-Reperfusion（Masson staining，×400）

3 討 論

3.1 自主跑輪運動抑制去卵巢大鼠心臟重塑

圖10 各組心肌梗死面積百分比的變化Figure10 Percentage of Myocardial Infarct Size in Each Group

心肌細胞間質對于維持心臟結構和功能的完整性具有重要意義，心肌間質中的膠原蛋白處于合成-降解動態變化中，當動態平衡被打破時將產生心肌纖維化以及心臟重塑，最終導致心功能障礙[17]。研究顯示[3]，雌激素及其受體在調節ECM代謝中起重要作用。本研究發現，與SC組比較，OV組大鼠CVF和Col-I含量增加，心臟和左心室質量以及HMI和LVMI升高，超聲心動圖顯示LVWT升高、LVEDD和LVEF下降，提示雌激素缺乏造成ECM代謝紊亂、心肌發生病理性肥大（向心性肥大）以及纖維化、心功能下降。心肌纖維化和心臟肥大導致心肌缺血缺氧、心臟硬度增加、心室壁順應性下降，進而影響心臟舒縮功能，此外還可增加心肌電異質性，易引發心律失常，是心血管疾病患者心源性猝死的重要原因[17]。由于雌激素缺乏可導致自主神經功能紊亂[18]、NO生物利用度下降[19]、細胞凋亡通路激活[20]以及心臟舒縮功能異常[21]，因此去卵巢大鼠發生缺血性損傷（例如心肌梗塞）后心臟重塑進程明顯加快[22]，更易發生心力衰竭。在本研究中，OV組離體缺血-再灌注時心肌梗死面積百分比較SC組明顯增加，提示去卵巢大鼠心臟對缺血-再灌注損傷應激的耐受能力減弱。

調控ECM穩態是治療多種心血管疾病的重要策略，運動訓練是防治心血管疾病的重要非藥物手段。在本研究中，8周運動后，OVE組CVF和Col-I含量較OV組下降，這與ALMEIDA等[23]、JITMANA等[24]、HUANG等[20]和MARQUES等[25]分別以8、9、10、13周跑臺運動以及FELIX等[26]以10周游泳訓練為模型的研究結果一致，提示長期規律體力活動（不論何種運動方式）能夠減輕去卵巢大鼠心肌膠原沉積。膠原減少有助于心動周期過程中心肌收縮力分布恢復正常并提高心壁順應性[27]，進而提升心臟舒縮功能。CHOI等[28]的研究進一步發現，長期（12周）有氧運動能夠減少心肌膠原交聯。總之，運動對膠原含量、結構（即空間排列）以及相互作用均具有有益作用，對雌激素缺乏誘導的心肌纖維化起抑制甚至逆轉作用。然而BENITO等[29]發現，健康大鼠進行18周大強度運動后心肌發生纖維化，SCHULTZ等[30]等證實，心力衰竭大鼠進行16個月自主跑輪運動后，心肌膠原沉積增加，提示過量運動可誘導或者進一步加重心肌重塑，即體力活動的心臟健康效應存在“負荷閾值”，超出這一閾值則造成適應不良[31-32]。

值得注意的是，本研究OVE組左心室質量、HMI以及LVMI與OV組并無顯著性差異，似乎說明去卵巢大鼠心臟肥大并未改善。然而超聲心動圖顯示，OVE組心腔內徑（LVEDD）較OV組升高，左心室形態上顯示“離心性肥大”，同時由于心功能改善，說明運動誘導心臟發生生理性肥大。然而LIAO等[33]和ROSSONI等[34]的報道證實，衰老大鼠分別進行13周和18周游泳運動后心臟肥大減輕（心臟質量和室壁厚度下降），但對心肌細胞體積無明顯影響，因此認為是ECM減少造成的（心臟質量或室壁厚度增加是心肌細胞體積增大和ECM增多共同作用所致）。研究結果不一致可能與動物模型、運動方式、運動負荷以及干預時間等因素有關。本研究結果與施曼莉等[35]等讓心肌梗塞后心力衰竭大鼠進行10周跑臺運動以及GARCIARENA等[36]讓自發性高血壓大鼠進行8周游泳運動的報道一致。針對游泳、長跑等耐力項目運動員的調查同樣顯示[37]，長期有氧運動可引起心室壁增厚、心腔擴大并伴隨心功能提高，其機制與運動時心臟前負荷（容量負荷，即回心血量）增加造成肌節串聯性增生有關[38]。由此推測，運動誘導的生理性心臟肥大與病理性肥大在去卵巢大鼠運動康復過程中同時存在并相互影響，最終前者的良性作用逆轉了后者的負面效應，表現為心臟由病理性肥大向生理性肥大轉變，同時心功能增強。此外本研究還發現，OVE組離體缺血-再灌注時梗死面積百分比較OV組顯著降低。研究指出，膠原沉積在心肌梗塞后心臟重塑中起促進作用[39]，而心肌膠原含量下降則可抑制去卵巢大鼠心肌梗塞后心臟重塑進程[23]。結合本研究結果我們認為，運動通過抑制去卵巢大鼠心肌纖維化不僅提高心臟安靜狀態下的舒縮功能，還可增強心臟對缺血-再灌注損傷應激的耐受性

3.2 自主跑輪運動激活MMP-2信號途徑并改善MMP-2/TIMP-2穩態平衡

心肌纖維化以及心臟重塑是多種因素相互作用的結果，其分子機制涉及ECM代謝中的多個信號轉導通路，其中MMP-2活性下降以及MMP-2/TIMP-2穩態失衡是最重要的原因[3]。MMP-2合成初始是以無活性的酶原（即無活性前體物質）形式存在（即72 kDa MMP-2），隨后通過翻譯后調控而活化（即64 kDa MMP-2，其蛋白表達量可代表MMP-2活性）[40]；TIMP-2是MMP-2的天然抑制物，可與MMP-2形成穩定復合物，阻礙酶原活化或抑制已活化的酶活性。在本研究中，OV組72 kDa MMP-2表達量在各組均無顯著性變化，說明雌激素下降對MMP-2酶原并無影響，但64 kDa MMP-2蛋白表達下調，提示MMP-2活性受到抑制，這與黃偉等[41]針對衰老大鼠的研究結果一致。然而心肌梗塞造成的心力衰竭大鼠心肌MMP-2表達上調，這可能是動物造模初期的代償性反應，或者MMP-2升高參與了心梗后瘢痕的形成過程[42]。研究結果存在差異甚至相互矛盾說明不同原因、疾病不同階段造成的心肌纖維化擁有截然不同的調控機制。OV組TIMP-2表達量與64 kDa MMP-2同步下降，似乎說明MMP-2活性以及對TIMP-2的抑制作用均減弱。YANG等[43]的研究指出，膠原代謝平衡最終由MMPs/TIMPs比值決定。本研究中64 kDa MMP-2/TIMP-2比值在OV組降低，說明MMP-2活性被TIMP-2抑制，降解膠原的能力下降，最終引起膠原沉積直至心肌纖維化。經過8周自主跑輪運動后，與OV組比較，OVE組64 kDa MMP-2和TIMP-2蛋白表達量均顯著性升高，這與KWAK等[44]以衰老大鼠為研究對象的研究結果一致，即12周中等強度跑臺運動可延緩增齡誘導的MMP-2活性下調。更為重要的是，OVE組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值較OV組升高，且與SC組無顯著性差異，提示TIMP-2對MMP-2的抑制作用得到解除。在甄潔[45]等的研究中，心力衰竭大鼠10周有氧運動后雖然TIMP-1和MMP-1蛋白表達量均下調，但MMP-1/TIMP-1比值增加，與本研究結果類似。總之，MMP-2/TIMP-2穩態平衡改善是自主跑輪運動抑制去卵巢大鼠心臟重塑的重要機制。

MMP-2可通過蛋白水解和非蛋白水解2條翻譯后調節途徑激活[11]。蛋白水解途徑中，72 kDa MMP-2酶原序列中抑制性前肽被切除后釋放具有酶活性的64 kDa MMP-2，非蛋白水解途徑即在GSH協助下由過氧亞硝酸鹽（ONOO-）對MMP-2酶原進行硝基化修飾而活化[10]。GSH是細胞內的非酶抗氧化劑，其含量減少可作為氧化應激的生物標記。ONOO-是超氧陰離子與一氧化氮（nitric oxide，NO）（活性氮的一種）的反應產物，最終代謝為3-NT。3-NT是蛋白硝基化終端產物，病理條件下產生的多種活性氧和活性氮導致機體氧化損傷，同時引起酪氨酸殘基發生硝基化而生成3-NT，故3-NT被認為機體氧化應激和蛋白硝基化的重要評估參數。然而在本研究中，OV組GSH和3-NT含量均下降，MMP-2基因翻譯后修飾作用減弱，MMP-2活性隨之下調。3-NT含量降低可能與NO合成與利用減少有關。研究顯示[2-3]，絕經后女性患心血管疾病的風險增加，包括心肌梗塞、高血壓等，其機制之一與氧化應激增強以及NO生物利用率降低有關。8周自主跑輪運動后，OVE組GSH含量增加，MMP-2活性上調，但3-NT并無顯著性變化。運動既可上調NO水平，同時又能夠下調自由基含量[23]，故兩者（NO＋超氧陰離子）反應產物ONOO-最終代謝為3-NT的含量在本研究OVE組與OV組之間并無顯著性變化。由于MMP-2非蛋白水解活化途徑需要GSH和ONOO-同時參與，因此即使ONOO-含量并未增加，GSH的升高依然能夠促進細胞內殘存的ONOO-對蛋白質進行硝基化修飾，進而激活MMP-2[46-47]。由此可見，運動通過激活MMP-2信號途徑并維持MMP-2/TIMP-2穩態平衡進而對去卵巢大鼠心肌產生保護效應。

4 結論

絕經期婦女心血管疾病發生率明顯增加，本研究以去卵巢大鼠為動物模型發現，雌激素缺乏誘導心臟重塑，表現為心肌纖維化、病理性心臟肥大、心功能下降，缺血-再灌注損傷加重，其機制與MMP-2/TIMP-2穩態失衡造成膠原代謝紊亂有關；而長期規律運動可能通過激活MMP-2信號途徑并改善MMP-2/TIMP-2穩態平衡抑制去卵巢大鼠心臟重塑（即心肌纖維化減輕，病理性心臟肥大向生理性肥大轉變，心功能提升）并增強心臟對缺血-再灌注損傷的耐受能力。因此，運動療法是防治絕經期女性心血管疾病的重要康復手段。