芎歸六君子湯對心肌梗死大鼠PI3K/Akt信號轉導通路的影響

鄭麗莉

(山東協和學院，山東 濟南 250109)

心肌梗死在心血管疾病中死亡率最高，且發病年齡呈年輕化趨勢[1]。治療性血管新生成為目前心梗治療的新途徑，該方法通過藥物治療促進缺血心肌微血管形成和冠狀動脈分支或側支循環的建立，減少心肌細胞的壞死和凋亡，促進心肌修復。芎歸六君子湯在《醫學正傳》六君子湯基礎上，加味補血活血之當歸、川芎組成，是治療脾胃氣虛，痰瘀內阻的常用方藥。前期研究[2]顯示，冠心病與脾胃具有相關性；芎歸六君子湯能改善心肌梗死大鼠胃腸道功能和心臟功能，減少梗死面積；調節血管新生相關因子如VEGF、FGF、MMP、TIMP、G-CSF等，促進梗死心肌邊緣微血管再生。本研究在此基礎上，進一步分析芎歸六君子湯對大鼠心肌邊緣Akt蛋白與基因的影響，探討芎歸六君子湯促進缺血心肌微血管再生的機制是否與PI3K/Akt通路有關，為臨床治療提供客觀依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠60只，SPF級，體質量(200±20)g，購自濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號SCXK(魯)20140007。

1.2 實驗藥物

1.2.1 中藥材來源

建聯藥店提供，山東中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定。人參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮、姜半夏、川芎、當歸，按3∶3∶3∶2∶1∶2∶3∶3比例，3次煎煮混合，水浴箱60 ℃濃縮，滅菌，1 mL藥液相當于0.63 g生藥。

1.2.2 對照藥

消心痛，國藥準字H19991039，魯南貝特制藥。復方丹參滴丸，國藥準字Z10950111，天津天士力公司。

1.3 實驗器材

Image-Pro PlusVersion4.5.1圖像分析系統；Synergy2酶標儀(Thermo multiskan ascent公司)；電泳儀(Bio-rad公司)； ABI PRISM 7000實時熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.4 實驗試劑

小鼠抗大鼠CD34單抗(美國Santa)；SP免疫組化試劑盒(批號12108A08)；羊抗兔二抗(Jackson公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物)；實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號D305)；Akt，p-Akt抗體(北京博奧森生物技術公司，批號依次為bs-2056R，Thr308)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

隨機分為5組，即假手術組、模型組、消心痛組、復方丹參滴丸組、芎歸六君子湯組。

2.2 給藥方法

假手術組、模型組、消心痛組、復方丹參滴丸組、芎歸六君子湯組，每日分別灌胃鹽水10 mL/kg、鹽水10 mL/kg、消心痛4.2 mg/kg、復方丹參滴丸85 mg/kg、芎歸六君子湯6.3 g/kg，共4周。

2.3 模型制備

大鼠麻醉，仰臥，連呼吸機，氣管插管。備皮消毒，胸部第2～3肋間偏左4～5 mm處開胸，剪開心包，擠出心臟，迅速結扎冠狀動脈左前降支，記錄肢體II導聯心電圖。結扎線下心跳減弱、顏色變白，ST段弓背抬高顯著，提示造模成功。假手術組穿線不結扎。術后肌注青霉素40萬U，連續3 d[3]。

2.4 檢測指標與方法

2.4.1 心功能測定

連續測量3個心動周期內的左室內徑、室壁厚度和血流速度，計算左室內徑縮短率(LVFS)、左室射血分數(LVEF)，結果為平均值。探頭頻率10～12 MHz[4]。

2.4.2 心肌梗死邊緣區微血管密度(MVD)測定

取梗死邊緣心肌，制片，SP法染色，一抗濃度1∶100。評定標準：找到心梗邊緣區，400倍視野下計數，棕黃色的單個內皮細胞計數為一個血管，但管腔超過8個紅細胞、帶有較厚肌層的血管除外。每張切片隨機計數5個視野,其均值即為該樣本的MVD 值[5]。

2.4.3 Western blotting法檢測梗死邊緣心肌總Akt(T-Akt)、磷酸化Akt( P-Akt)蛋白的表達

標本100 mg，提總蛋白，BCA 法測定含量。取50 μg總蛋白，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉膜，于1% 脫脂奶粉TBST緩沖液封閉，加一抗，4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育，洗膜，顯色，凝膠成像系統分析結果，以β-actin為內參。以P-Akt、T-Akt的條帶與β-actin的光密度比值表示蛋白的表達水平。

2.4.4 實時熒光定量

RT-PCR 檢測檢測梗死邊緣心肌Akt mRNA表達：取梗死邊緣組織，TrizoL試劑盒提取總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉錄合成cDNA；實時熒光定量PCR儀進行反應。反應參數:95℃預變性15 min，1個循環;95℃變性10 s，60℃20 s，72℃延伸30 s，40個循環。采用相對定量2-△△Ct法比較各組Akt mRNA表達差異[6]。大鼠Akt上游引物5,-TAGGCATCCCTTCCTTACAGC-3，下游引物5,-CGCTCACGAGACAGGTGGA-3，退火溫度60℃，擴增產物長度113 bps；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照，大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物5,-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3，下游引物5,-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3，退火溫度60℃，擴增產物長度95 bps。

2.5 統計方法

3 實驗結果

3.1 芎歸六君子湯對心梗大鼠心功能的影響

與假手術組相比，模型對照組超生心動圖顯示LVEF、LVFS降低，說明心臟功能顯著下降(P<0.01)。給藥后各組顯著改善，其中芎歸六君子湯組效果最為顯著(P<0.01)。見表1。

3.2 芎歸六君子湯對大鼠心梗邊緣微血管數量和密度的影響

與假手術組相比，模型對照組新生微血管數量顯著增加(P<0.01)，說明心肌梗死后自發性微血管新生進行修復。各用藥組微血管數量較之模型對照組顯著增加(P<0.01)，且芎歸六君子湯組微血管數量最多(P<0.01)。見表1。

分組LVEF(%)LVFS(%)MVC/MVD假手術組79.35±5.1548.23±3.5411.45±1.33模型對照組 42.36±3.24ΔΔ21.39±2.65ΔΔ32.57±3.52ΔΔ消心痛組56.81±4.53▲▲26.16±3.23▲▲46.51±4.57▲▲丹參滴丸組58.37±4.27▲▲28.73±2.31▲▲51.28±4.33▲▲芎歸六君子湯組68.53±5.13▲▲★★●●37.56±2.57▲▲★★●73.65±5.14▲▲★★●●

注：與假手術組相比，ΔΔP<0.01；與模型對照組相比，▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★★P<0.01；與丹參滴丸組相比，●P<0.05,●●P<0.01

3.3 芎歸六君子湯對梗死邊緣心肌組織Akt蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型對照組總Akt、磷酸化Akt及二者比值均顯著升高(P<0.05)，說明心肌梗死后Akt蛋白表達增多。各用藥組較之模型對照組顯著升高，芎歸六君子湯組效果顯著優于消心痛組及丹參滴丸組(P<0.05)。見表2。

分組nT-AktP-AktP-Akt/T-Akt假手術組120.428 1±0.014 20.102 6±0.012 10.239 1±0.011 2模型對照組120.520 8±0.025 1Δ0.180 1±0.013 4Δ0.345 7±0.007 9Δ消心痛組120.601 7±0.015 8▲0.291 4±0.015 2▲0.484 3±0.013 5▲丹參滴丸組120.616 0±0.016 5▲0.301 6±0.015 6▲0.489 6±0.015 1▲芎歸六君子湯組120.755 4±0.014 8▲▲★●0.426 9±0.014 7▲▲★●0.565 1±0.013 4▲▲★●

注：與假手術組相比，ΔP<0.05；與模型對照組相比，▲P<0.05,▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★P<0.05；與丹參滴丸組相比，●P<0.05

3.4 芎歸六君子湯對梗死邊緣心肌組織Akt mRNA表達的影響

與假手術組相比，模型對照組Akt mRNA表達升高顯著(P<0.01)。各給藥組均有增加，其中芎歸六君子湯組增加最為顯著(P<0.05)。見表3。

4 討論

心肌梗死是指在冠狀血管病變基礎上，冠脈的血流急劇減少或中斷，使心肌長時間缺血缺氧，最終導致心肌壞死。心梗發生后，凋亡相關機制首先啟動，凋亡復合體形成，多種蛋白酶被活化，進而誘導心肌細胞凋亡。急劇缺血缺氧導致肌原纖維斷裂，肌絲增寬，左室進行性擴張，心功能下降。治療性血管再生可促進冠脈側支循環的建立和開放，為缺血心肌提供血供，減少心肌細胞的凋亡，有效改善心功能，成為心梗治療的研究熱點。

分組n△Ct△△Ct2-△△Ct假手術組122.523 3±0.009 8 0±0.009 8 1±0.006 8模型對照組12 1.458 9±0.025 3-1.064 4±0.025 32.091 7±0.036 8ΔΔ消心痛組121.282 4±0.052 6-1.241 0±0.052 62.365 0±0.085 7丹參滴丸組120.946 3±0.065 6-1.577 1±0.065 62.986 5±0.133 8▲▲★芎歸六君子湯組120.573 3±0.068 9-1.950 0±0.068 93.867 8±0.186 0▲▲★★●

注：與假手術組相比，ΔΔP<0.01；與模型對照組相比，▲▲P<0.01；與消心痛組相比，★P<0.05,★★P<0.01；與丹參滴丸組相比，●P<0.05

LVEF和LVFS是反映心功能的重要指標。LVEF是指心室舒張末，每搏輸出量與心室容積的比例，反映心室的收縮力和射血能力。LVFS代表左心室環形心肌的收縮能力[7]。研究顯示，芎歸六君子湯給藥4周后，LVEF和LVFS顯著提高，說明左室收縮和舒張功能以及室壁順應性顯著改善。

MVD指每個視野內微血管數量，能夠較準確反映梗死心肌微血管新生的情況。CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，選擇性地表達于造血干/祖細胞表面，是血管生長過程中的內皮細胞表面標志物，會隨著細胞的成熟逐漸減弱至消失。研究結果顯示，模型組微血管數量顯著高于假手術組，說明心梗后出現了自發性代償性微血管新生，與心肌缺血缺氧、炎癥反應等有關，但此種再生非常緩慢，難以形成有效的側支循環。各給藥組尤其是芎歸六君子湯組微血管數量顯著高于模型對照組，說明給藥后，微血管數量增加，更能及時促進側支循環形成，增加血供。

血管新生是一個高度受控的復雜的程序化的級聯過程，血管內皮細胞的增殖、遷移是基礎性環節，多種內皮細胞生長因子和信號通路參與其中。心肌缺血缺氧會激活PI3K/Akt 信號傳導通路，即磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PKB或Rac)通路。該通路廣泛存在于細胞中，在細胞生長、增殖、分化、遷移等多種生理活動發揮關鍵作用，其功能涉及細胞周期調控、細胞增殖、細胞凋亡和細胞運動等諸多方面。

PI3K下游有多種效應分子，其中Akt處于通路的關鍵環節。許多生長因子、激素、細胞因子與其相對應的受體結合，活化脂質激酶 PI3K，并且激活 Akt，在細胞質膜中生成 PIP3。Akt與 PIP3 相結合，導致 Akt 轉位至細胞膜。活化的Akt能夠通過下游多個凋亡、增殖等調控因子，減少心肌細胞凋亡，促進血管新生，減輕心肌損傷。第一，Akt能促進抗凋亡蛋白Bcl-2 生成，抑制 Bax、Bad 及 caspase等促凋亡蛋白的形成，或者使 GSK-3β(糖原合成酶激酶 3β)發生磷酸化而失去誘導細胞凋亡的能力，多途徑抑制細胞凋亡，發揮心肌保護作用[8]。第二，Akt可以介導血管內皮細胞的生長。VEGF和bFGF可以增加微血管的通透性，促進血管內皮細胞的增殖和遷移，是參與血管新生的重要生長因子。VEGF通過整合素相關激酶(ILK)誘導Akt/PKB的磷酸化，抑制Akt/PKB蛋白降解，增加絲/蘇氨酸激酶的穩定性，從而誘導內皮細胞增生和移行[9]。PI3K/Akt可以激活激酶鼠雙微體基因-2 編碼蛋白，促進細胞分泌 VEGF；同時，VEGF可反饋性激活PI3K/Akt通路，進一步促進血管新生[10]。bFGF與FGFRl受體結合，通過PI3K/Akt通路將信號傳入細胞核內，促進調節內皮細胞生長、增殖和遷移[11]。

芎歸六君子湯源于《醫學正傳》六君子湯加味當歸、川芎而成，功能補氣化痰活血，多用于治療脾胃疾病證屬氣虛痰瘀者。該研究用于治療心肌梗死，人參、白術、茯苓、甘草健脾補氣，氣有推動之功效，可以改善心臟功能，促進射血能力。氣能生血，脾胃為氣血生化之源，促進血液化生，促進微血管新生；心梗后，氣血瘀滯，瘀血不去，新血不生，通過川芎、當歸和半夏等活血化痰，祛除痰瘀，加之當歸兼具補血活血之效，進一步促進新血生成，與本實驗結果微血管新生、側支循環建立相吻合。關于對PI3K/Akt通路的影響，說明中藥可以通過多途徑、多靶點對疾病進行干預，體現了中醫整體論證的優勢。

綜合以上研究，可初步推斷，芎歸六君子湯促進梗死心肌血管新生的原理，可能與PI3K/Akt 信號通路激活，皮細胞增殖、分化和遷移相關。前期研究顯示，芎歸六君子湯能顯著促進VEGF和bFGF在心肌中的蛋白和基因表達，結合本研究結果，PI3K/Akt 信號通路的激活，可能依賴于VEGF和bFGF與相應特異性受體的結合。關于VEGF和bFGF與PI3K/Akt通路的相關性，尚有待進一步實驗探討。