染色體拷貝數變異國家參考品的制備及標定

賈崢 張文新 李麗莉 孫楠 曲守方 黃杰

拷貝數變異（copy number variations，CNVs）指在人類基因組中廣泛存在的，從1 000 bp到數百萬bp范圍的缺失、插入、重復和復雜多位點的變異，主要表現為染色體亞顯微水平的缺失和重復，是由基因組發生重排而導致的[1]，常導致人類復雜性疾病如腫瘤[2]、自閉癥[3]、精神分裂癥[4]、先天畸形[5]、發育遲緩和智力低下[6-8]。

隨著分子生物技術的發展，染色體拷貝數變異檢測的方法也由傳統的核型分析[9]，發展到熒光原位雜交技術法（fluorescence in situ hybridization，FISH）[10]、熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）和多重鏈接探針法（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）[11-12]、染色體微陣列分析（chromosomal microarray，CMA）[13-16]和高通量測序技術（Next generation sequencing technology，NGS）[17]等。然而目前在染色體拷貝數變異檢測中，國內外都缺乏統一認可的國家參考品。本實驗室計劃研制一套能夠進行染色體拷貝數變異檢測性能評估的國家參考品，為相關試劑盒的注冊檢定及臨床檢驗室間質評提供優質可靠的國家參考品。

1 材料與方法

1.1 研究對象

招募自愿參與項目的臨床樣品捐獻者。部分微缺失微重復樣本是通過EB病毒轉染永生化獲得的外周血B淋巴細胞系樣本。本研究共收集到3份正常人樣本，24份染色體非整倍體異常樣本，11份微缺失微重復樣本。

1.2 主要試劑

康寧公司的DNA提取試劑盒AxyPrep Mag Tissue-Blood genomic DNA（gDNA）Kit（磁珠法）；染色體拷貝數變異檢測試劑盒（聯合探針錨定聚合測序法），批號：28180101Y，深圳華大智造科技有限公司（以下簡稱為A公司）提供；染色體拷貝數變異檢測試劑盒（可逆末端終止測序法），批號：GM016-P320180102，杭州杰毅麥特醫療器械有限公司（以下簡稱為B公司）提供；染色體拷貝數變異檢測試劑盒，（可逆末端終止測序法），批號：R2000180301，杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司（以下簡稱為C公司）提供；13/16/18/21/22/X/Y染色體非整倍體檢測試劑盒（微陣列芯片法），批號：201703，廣州市達瑞生物技術股份有限公司（以下簡稱為D公司）提供。

1.3 主要儀器

BGISEQ-500基因測序儀，A公司提供；Next-Seq CN500基因測序儀，B公司和C公司提供；GCS 3000Dx v.2微陣列基因芯片分析系統，D公司提供。

1.4 方法

1.4.1 國家參考品的制備

按照DNA提取試劑盒說明書進行38份樣本基因組DNA的提取，選取5例微重復微缺失DNA與正常人的基因組DNA量進行3∶7比例混合得到5例30%微缺失微重復嵌合樣本，即最終得到43份樣本。將提取的基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測DNA樣本的完整性。使用NanoDrop對得到的基因組DNA測定OD260/OD280和OD260/OD230值來檢測DNA樣本的純度，并使用瓊脂糖凝膠電泳方法對基因組DNA的完整性進行檢測。最后使用Qubit Fluorometer3.0對基因組DNA進一步準確定量，然后將DNA樣本稀釋到15（±1）ng/μL。采用NGS對每個DNA樣本進行實驗驗證，將驗證合格的DNA樣本進行分裝，并貼上標簽。

1.4.2 國家參考品的性能驗證

分別使用4家協作標定單位生產的染色體拷貝數檢測試劑盒，按照試劑盒的說明書進行操作，評價國家參考品的性能。

1.4.3 國家參考品的穩定性和均勻性驗證

DNA樣本常規均在-20℃以下保存，且運輸過程中均使用干冰或冰袋保存。為了驗證國家參考品的穩定性，隨機選兩套國家參考品，其中一套國家參考品放置于37℃條件下4周；另一套國家參考品放置于37℃條件下4周，期間拿出反復凍融3次（每隔4天一次）。采用A公司的染色體拷貝數變異檢測試劑盒對這兩套國家參考品進行檢測，用來評價國家參考品的穩定性，同時隨機取三套國家參考品，進行均勻性驗證。

2 結果

2.1 國家參考品的制備及驗證

在分子生物學實驗中基因組DNA的提取是進一步研究基因組結構、功能和指紋遺傳標記等的第一步，提取的DNA的完整性和純度是后續諸多復雜高級實驗分析成敗的關鍵。對于43份樣本提取的基因組DNA進行電泳，電泳圖譜結果顯示DNA條帶完整和銳利，沒有拖帶或彌散帶，符合實驗室對基因組DNA完整性的要求，見圖1。采用紫外分光光度檢測，提取的DNA樣品的OD260/OD280值基本在1.8～2.15之間，表明DNA的純度較高。經高通量測序方法對每個樣本進行拷貝變異的檢測，樣本的DNA檢測結果均與原始樣本的信息一致，最后按照17 μL體積進行分裝。

圖1 43份樣本提取的DNA質量驗證Figure1 The quality of extracted genomic DNA from 43 samples

2.2 國家參考品的性能驗證

實驗室邀請4家協作標定單位，選擇了高通量測序法和基因芯片法對國家參考品進行性能驗證。四家單位驗證結果見表1，其中A單位和B單位對國家參考品43份樣本的檢測結果均與參考品標示的結果一致；C單位除了檢測出參考品標示的結果外，還有9份樣本多檢出其他的拷貝數變異，包含了7份樣本多檢出1個小于1M的重復片段，1份樣本多檢出1個小于1M的缺失片段，另有1份樣本檢測出1個21.6M的缺失片段；D單位對國家參考品中40號樣本未檢測到1p36嵌合型微缺失，其他42份樣本均檢測出參考品標示的結果，另外還有4份樣本多檢出其他的拷貝數變異，包括1份樣本較其他三家單位多檢出一個3.7 M的片段重復以及其他3份樣本分別多檢測出11.3 M，12.7 M，29.8 M的缺失片段。

為了評價試劑盒的嵌合體樣本檢測能力，設置了微缺失微重復嵌合體（約30%嵌合比例）樣本。3家單位的基于高通量測序方法的試劑盒，對5份樣本均能正確檢出；而40號樣本存在著兩種嵌合體（約30%嵌合比例），基于基因芯片法的試劑盒存在著漏檢現象。四家單位對Wolf-Hirschhorn綜合征30%嵌合的檢測結果如圖2所示，4家協作單位均對該綜合征檢出。

2.3 國家參考品的穩定性和均勻性驗證

標準物質的均勻性和穩定性亦是重要的條件。均勻性可保證一批原料所制備的標準物質均勻一致，穩定性可使一批標準物質長期分發使用，以保持特性值的連續性。實驗室通過對兩種不同的處理方法：37℃放置4周，期間反復凍融（稱為條件1）；或者37℃放置4周（稱為條件2）后由A公司使用高通量測序方法進行國家參考品穩定性和均勻性驗證，結果如表2所示。

通過對這兩套國家參考品的穩定性進行檢測，結果均與國家參考品標示的結果一致，表明國家參考品穩定性滿足要求。同時使用一家協作標定單位的染色體拷貝數變異檢測試劑盒，檢測不同的3套國家參考品，作為參考品均勻性的驗證，結果表明該3套國家參考品的結果均與國家參考品標示的結果一致，表明均勻性也滿足要求。

3 討論

大量研究表明，基因組變異是人類進化、疾病產生和發展的重要因素之一，其中拷貝數變異作為人類基因組中重要的結構性變異，在病理和生理中扮演著重要的角色。近年來，隨著基因組測序技術的迅猛發展，拷貝數變異的檢測精度已達到50 bp[18]。其中特征性的CNVs可以作為染色體病的診斷指標，而準確的檢測則是發現和揭示這些CNVs的前提。根據特征性的CNVs，可對相應的疾病進行準確診斷并提出相對應的最有效的解決方法。目前我國還沒有拷貝數變異的國家參考品，而市場上存在高通量測序方法、微陣列比較基因組雜交芯片法（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）及微陣列單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技術等多個不同原理的檢測平臺。所以為了更好的評價不同公司以及不同使用平臺的體外診斷試劑盒的生產質量和工藝優化水準，建立標準化的統一的國家參考品是非常必要的。

表1 4家協作標定單位驗證結果Table1 Verification results of references by detection kits from four manufacturers

續表1

圖2 4家協作標定單位對Wolf-Hirschhorn綜合征30%嵌合樣本的檢測結果Figure2 Verification results of 30%Wolf-Hirschhorn syndrome by detection kits from four manufacturers

表2 不同處理條件對參考品穩定性的影響Table2 Stability of references treated under various conditions

該國家參考品中除了1號和19號染色體屬非整倍體外，其他染色體的非整倍體均已包含，同時增加了臨床上相對常見或發病率較高的綜合征樣本，更能有效的評價試劑盒的臨床意義。根據生物制品國家標準物質制備和標定規程，用于制備標準物質的原材料應有足夠的穩定性和高度的特異性，并有應有足夠的數量[31]。因此，本研究所制備的參考品選用了流產組織樣本及細胞系能確保基因型背景明確、原料來源穩定，且滿足標準物質制備的量要求及換批時一致性的樣品。

在4家公司對參考品進行標定的結果中，除了一家協作標定單位在使用含有單核苷酸多態（SNP）探針的微陣列芯片法進行驗證時，結果中有一例嵌合體參考品并未正確檢出外，其他3家單位對國家參考品所有的標示結果均有正確檢出。究其原因，可能是由于SNP探針的基因芯片法檢測拷貝數的原理需要通過SNP位點信息來區分等位基因，對于真實臨床樣本的嵌合來說（包括父源和母源染色體），30%嵌合比例的樣本可以用該芯片法進行準確判讀。而國家參考品的嵌合參考品是由拷貝數正常和異常樣本按照一定的比例配制而成的模擬樣本，這種人工配制的嵌合型參考品會對SNP探針的微陣列芯片法的檢測質控和結果均有一定程度的干擾，從而影響了對微缺失微重復綜合征（30%嵌合體）檢測限樣本的檢測準確性。

從分析結果來看，該參考品具有較好的穩定性和均勻性，可滿足運輸穩定性的要求。該參考品需在低溫冷凍條件下進行長期保存，根據國際慣例，目前人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質不設“有效期”，由我院對標準物質進行定期監測。

綜上所述，本實驗室制備了染色體拷貝數變異檢測國家參考品，該參考品可滿足染色體DNA拷貝數變異的檢測要求，經多家實驗室進行驗證，可用于國內大多數試劑盒的性能評價及臨床實驗室質量評價。