百日咳臨床流行病學特點及診斷方法的比較研究

李玥 袁林 王青 高薇 史偉 孟慶紅 于丹 姚開虎

百日咳是由百日咳鮑特菌引起的呼吸道傳染病。百日咳早期診斷主要依賴患兒的典型臨床表現，容易漏診和誤診不典型病例。目前百日咳確診依賴于實驗室診斷，但不同國家和地區采用的實驗室診斷標準常有差異。歐美發達國家多推薦細菌培養和核酸檢測作為百日咳主要的實驗室病原檢測方法[1]。普通PCR法靈敏度高于細菌培養法[2]，但檢測樣本易變污染且無法準確定量，熒光定量PCR法可以實現對微量病原核酸樣本精準、實時、定量檢測，是百日咳臨床檢測方法研究領域的前沿熱點[3]。本研究分別采用細菌培養和熒光定量PCR 2種方法，檢測了北京兒童醫院2017年4月至2018年3月一整年度共864例送檢患兒的鼻咽拭子，探討百日咳臨床流行病學特點和2種實驗室方法在檢測兒童百日咳中的臨床應用價值，以期為進一步認識這2種診斷方法所反應出的百日咳流行病學是否存在差異，為選擇百日咳實驗室診斷方法提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

北京兒童醫院2017年4月至2018年3月共864例送檢患兒的病歷資料和采集的雙側鼻咽拭子，其中男520例（60.2%），女344例（39.8%），患兒中位年齡為5月齡，年齡范圍為＜1月齡～13.7周，404例患兒符合臨床診斷的百日咳標準。臨床診斷百日咳標準[美國疾病預防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC），2014][4]為患者咳嗽≥2周，并具有≥1個下列癥狀：①陣發性咳嗽；②吸氣性回聲；③咳嗽后嘔吐；④呼吸暫停（伴或不伴有紫紺，僅適用于1歲以下嬰兒）。收集臨床資料包括患兒地區分布、時間分布、抗生素治療史等，臨床表現包括咳嗽發汗、結膜下出血、舌系帶潰瘍等。

1.2 鼻咽拭子樣本采集

采樣人員手持細長拭子，經鼻垂直于面部或人體冠狀面插入直至鼻咽后壁，充分接觸和擦拭鼻咽后壁表面后取出。經左右側鼻腔分別采集一份拭子樣本[5]。

1.3 實驗室診斷方法

1.3.1 細菌培養

采集拭子后即刻床旁接種，以拭子反復“Z”字型劃線接種于碳瓊脂選擇培養基，置于37℃孵箱培養。3天后開始每天檢查培養皿至第7天。若見灰白色、圓形、半透明的疑似菌落，應繼續分純并對最終收集到的菌株進行百日咳鮑特菌血清玻片凝集試驗，百日咳鮑特菌抗血清凝集陽性、副百日咳鮑特菌抗血清陰性確認為百日咳鮑特菌。鼻咽拭子在接種后放置于-70℃保存，后期進行統一PCR檢測。

1.3.2 熒光定量PCR檢測

采用離心柱法提取核酸，核酸提取純化試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司（貨號：Cat。#DA-451），按照試劑盒說明書提取核酸后收集待檢測。百日咳鮑特菌核酸檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司在研項目（項目編碼：G（2012）025），按照試劑盒說明書配置反應體系、設置反應條件。結果判定標準參照試劑盒說明書：檢測通道無擴增曲線判為百日咳陰性，檢測通道有擴增曲線且Ct值＜40判為百日咳陽性。

1.4 統計學分析

應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以表示，計數資料以（%）來表示，兩樣本間率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流行病學特征

細菌培養和熒光定量PCR 2種方法檢出百日咳鮑特菌陽性樣本分別數為208例和399例，分別占送檢患兒總數的24.1%（208/864）和46.2%（399/864）。

2.1.1 年齡分布

臨床診斷百日咳組、熒光定量PCR陽性組和細菌培養陽性組患兒的中位年齡相似，分別為6月齡、5月齡和5月齡。不同標準診斷的患兒均以嬰兒為主（77.5%～89.3%），其中≥3月齡～＜6月齡的嬰兒最多，分別為131例（32.4%）和132例（33.1%）和69例（33.2%）。其他各年齡段人群分布，詳見表1。

2.1.2 地區分布

臨床診斷百日咳組、熒光定量PCR陽性組和細菌培養陽性組患兒均以河北地區居多，分別為168例（41.6%）、175例（43.9%）和94例（45.2%）；第二位為北京，分別為 147例（36.4%）、171例（42.9%）和88例（42.3%）。其余患兒主要來自京津冀及周邊地區，如天津、山東、內蒙、河南等，詳見表1。

表1 臨床診斷百日咳和實驗室診斷百日咳患兒一般資料比較[n（%）]Table1 General information of clinical and laboratory diagnosed pertussis patients[n（%）]

2.1.3 抗生素治療

臨床診斷百日咳組、熒光定量PCR陽性組和細菌培養陽性組抗生素使用比例均超過50%，使用最多的抗生素種類主要為大環內酯類抗生素（72.1%～75.7%），其次為頭孢類抗生素（58.6%～60.1%），詳見表1。

2.1.4 季節分布

2017年4月至2018年3月全年12個月的細菌培養陽性樣本數、熒光定量PCR陽性樣本數以及臨床診斷百日咳患兒數變化趨勢見圖1。5月～9月診斷病例數較多，占年診斷病例數的63.4%～74.5%；在此期間月臨床診斷病例中位數為49例（38例～73例），熒光定量PCR陽性樣本中位數為56例（42例～70例），細菌培養陽性樣本中位數為32例（21例～53例）。10月份至次年3月份病例數減少，月臨床診斷病例中位數為20例（5例～35例），熒光定量PCR陽性樣本中位數為19例（9例～22例），細菌培養陽性樣本中位數為8例（4例～10例），詳見圖1。

圖1 全年百日咳檢出數量隨月份變化趨勢Figure1 Pertussis detection yearly

2.2 2種病原菌檢測方法的比較

2.2.1 患兒臨床特征比較分析

以864例送檢患兒為基數，熒光定量PCR陽性組和細菌培養陽性組中陣發性咳嗽、吸氣性回聲、咳嗽后嘔吐、陣發性青紫、呼吸暫停、咳嗽發汗、結膜下出血等臨床癥狀的比例，細菌培養陽性組均高于熒光定量PCR陽性組，其中吸氣性回聲比例在兩組間具有顯著性差異（χ2=5.086，P=0.024），其他臨床癥狀的差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 細菌培養與熒光定量PCR陽性患兒臨床癥狀的比較[n（%）]Table2 Comparison of clinical characteristics of bacterial culture and Q-PCR positive samples[n（%）]

2.2.2 靈敏度和特異度比較分析

864 例送檢患兒中滿足臨床診斷標準者406例，458例不滿足百日咳臨床診斷標準。以臨床診斷為標準，細菌培養和熒光定量PCR2種方法檢測的靈敏度分別為27.1%（110/406）和51.5%（209/406），特異度分別為 79.0%（362/458）和 59.0%（270/458）。細菌培養或熒光定量PCR檢測為陽性但不滿足臨床診斷者193例，其中咳嗽不滿2周者151例，咳嗽超過2周但缺乏典型咳嗽性狀（陣發性咳嗽、吸氣性回聲和咳嗽后嘔吐）者42例。咳嗽不滿2周的151例中，具有至少一種典型咳嗽性狀者133例。

3 討論

中國疾病預防與控制中心發布的2011-2017年百日咳流行病學特征顯示，百日咳具有夏秋季多發，在男性、小年齡兒童中高發的流行病學特征[6]。本研究數據同樣顯示，嬰兒是診斷百日咳病例的主要易感人群，其中≥3月齡～＜6月齡的小年齡嬰兒最多，男性比例占60.2%，4月起百日咳診斷病例開始逐漸增多，5月-9月達高峰，9月后逐漸降低，以上流行病學特征與百日咳全國流行特點相符。以往研究[2，7，8]中很少將臨床診斷與病原學檢測診斷所反應出的百日咳流行病學特點進行比較分析。本研究顯示，臨床診斷與2種病原學檢測診斷的百日咳所反應的臨床流行病學特征基本一致，提示只要嚴格執行標準，基于其中任何一種標準進行百日咳監測，都能反映百日咳的流行病學特征和動態變化。在無條件開展病原學檢測的地方，完全可以通過臨床診斷監測百日咳流行狀況。

本研究數據以百日咳臨床診斷為標準時，核酸檢測法的靈敏度為細菌培養法靈敏度的1.9倍。大多數類似研究認為核酸檢測法的靈敏度約為細菌培養法的 2～6 倍[7-8]，如袁林等[9]研究顯示核酸檢測法的靈敏度為細菌培養法靈敏度的3倍，但也有報道中此比例高至29倍[10]。造成這一比例高低不一的原因與方法學和患者特點有關。細菌培養法涉及的環節較多，各實驗室樣本采集、轉運、分離培養、鑒定等環節的差異都會導致檢測靈敏度不同[11]，核酸檢測法中探針、引物、結果判定標準的差異也會導致靈敏度的不同[12]。另外，不同研究中納入的患兒接受抗生素治療和疫苗接種的情況不同，抗菌藥物治療可降低呼吸道標本中病原菌豐度[13]；疫苗可以減輕百日咳發病和傳播，也可能影響細菌增殖數量[14]，這些因素都可能間接影響2種檢測方法的靈敏度。因此制定2種實驗室診斷方法的標準操作規范和統一的指導原則對百日咳實驗室診斷至關重要。

本研究中細菌培養或熒光定量PCR檢測為陽性但不滿足臨床診斷者193例，這些患者中主要是咳嗽持續時間不足2周的患兒，咳嗽2周但缺乏百日咳典型咳嗽者較少，提示臨床診斷標準（美國CDC，2014）不能及時發現咳嗽時間不足2周的病例，因此應該加強對咳嗽早期可疑病例，尤其是咳嗽不足2周，但具有典型咳嗽性狀者的篩查。另一方面，百日咳治療時早期應用抗生素對緩解癥狀及縮短病程均有益，更加凸顯了病原菌早期診斷的重要性。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）已對“咳嗽≥2周”作為百日咳臨床診斷標準進行了修改，在WHO更新的百日咳臨床診斷標準（2018年9月）[15]中，“咳嗽≥2周”已不作為臨床診斷百日咳的必須條件。

綜上，臨床診斷、細菌培養和特異核酸診斷百日咳揭示的臨床流行病學特征相似，都可以作為百日咳臨床連續監測的手段。以臨床診斷為標準，細菌培養診斷百日咳靈敏度低、特異度高，熒光定量PCR靈敏度較高、特異度較低。實驗室檢測能發現更多臨床不典型病例，尤其有利于發現咳嗽早期不滿足臨床診斷標準的病例。核酸檢測和細菌培養2種病原菌檢測方法各具優勢，相互補充可降低臨床漏診、誤診率。核酸檢測試劑也亟待標準化和商品化，以盡快滿足臨床使用要求。