一種常見致病菌耐藥基因檢測芯片的建立及其應用

郭健蓮 肖斌龍 劉惠娜 江先海 徐忠玉

細菌耐藥性的監測，對于控制醫院感染耐藥菌株的發生，促進抗菌藥物的合理使用具有重要意義[1]。目前常規檢驗手段是藥敏實驗，得出結果需要至少2～3天，甚至更長周期，而對于重癥監護病房（intensive care unit，ICU）等對時效性要求較高的科室而言，如此長的周期給其及時診治帶來了障礙，臨床迫切需要能快速、準確監測細菌耐藥性的方法。隨著分子診斷技術迅速發展，基因芯片在細菌耐藥監測方面體現出極大的優勢[2]。本研究通過設計一種新的耐藥基因芯片，對6種常見致病菌進行芯片檢測[3-4]，以期快速、高效地監測其相應細菌的耐藥情況，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2016年1月至2017年6月間臨床送檢的傷口分泌液中所分離的病原菌237株，其中革蘭氏陽性菌74株（金黃色葡萄球菌41株、腸球菌33株），革蘭氏陰性菌163株（大腸埃希菌57株、肺炎克雷伯菌39株、鮑曼不動桿菌32株、銅綠假單胞菌35株）。

1.2 主要試劑

NC33和PC50鑒定藥敏板條（德國西門子公司）；液體LB培養基[上海生工生物工程（上海）股份有限公司]；CTAB/NaCl溶液（北京索萊寶科技有限公司）；苯酚/氯仿/異戊醇混合液（國藥集團化學試劑有限公司）；探針用點樣液（6×SSC，0.1%SDS）（北京博奧生物有限公司）；醛基化玻片（北京博奧生物有限公司）；及雜交液（5×SSC，5×Denhardt，10 μg/mL鮭魚DNA，0.3%SDS）均為北京博奧生物有限公司產品。

1.3 主要儀器

微生物鑒定藥敏測試系統MicroScan walk-Away-96（德國西門子公司）；ABI 2720 PCR擴增儀[美國應用生物系統（ABI）公司]；基因芯片掃描儀GenePix 4000B（美國Axon公司）。

1.4 方法

1.4.1 細菌鑒定和藥敏試驗

通過微生物鑒定藥敏測試系統MicroScan walkAway-96，分別使用NC33和PC50鑒定藥敏板條對革蘭氏陰性菌（9類常用抗生素）和革蘭氏陽性菌（11類常用抗生素）進行藥敏測試。藥敏結果按照CLSI-2013版標準[5]進行判定。

1.4.2 檢測引物和探針的設計

根據GeneBank和抗生素耐藥基因數據庫（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB）公共數據庫下載得到常用類抗生素（革蘭陽性菌11類和革蘭陰性菌9類）的主要耐藥基因的基因序列，然后使用MegAlign程序進行序列比對，選擇序列保守區域使用PrimerSelect軟件進行引物及探針設計。使用NCBI中的Primer-BLAST程序對引物及探針進行特異性檢測，以確定引物和探針的特異性。耐藥基因引物及探針序列見表1。

1.4.3 基因芯片制備和雜交

將制備的探針用點樣液稀釋至終濃度為50 μmol/L，各取6 μL置于384孔板上，用微陣列點樣儀點到醛基化玻片上，每個點重復3次；同時設置空白對照，點樣模式詳見表2。將點樣后的芯片室溫放置至少20 h。使用時用0.2%SDS洗去芯片上的一些未共價結合的寡聚核苷酸，然后用超純水沖洗殘余的SDS，自然晾干，備用。

1.4.4 致病菌DNA基因組的提取和純化

革蘭氏陽性菌采用玻璃珠法，革蘭氏陰性菌采用十六烷基三甲基溴化銨法，分別提取DNA基因組。取10 μL提取的基因組DNA溶液加1.99 mL水稀釋后測量OD260和OD280值，蒸餾水作為空白，計算OD260/OD280比值和DNA濃度（1 OD260=50 μg/mL DNA）。

1.4.5 多重PCR擴增反應

按照每一管檢測6個耐藥基因進行多重PCR擴增。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s，53℃～58℃退火 1 min，72℃延伸3 min，共40個循環；最后72℃延伸10 min。總共檢測54個耐藥基因。

表1 耐藥基因的引物和探針序列Table1 Sequences for primers and probes of drug-resistant genes

續表1

表2 基因芯片點樣模式Table2 Gene chip dot pattern

1.4.6 芯片雜交和洗片

將PCR產物放入PCR擴增儀中95℃變性5 min，迅速置于0℃的冰上5 min；取變性過的PCR擴增液1 μL與9 μL雜交液混勻，然后轉移至芯片的雜交區域。將芯片置于雜交盒中，50℃水浴保溫1 h。將雜交后的芯片依次在室溫下用洗液A（1×SSC，0.2%SDS）、洗液B（0.2×SSC）和洗液C（0.1×SSC）中各洗滌 1 min，最后在 ddH2O中洗滌1 min。從ddH2O中取出芯片后立即置于避光的50 mL離心管中，在臺式冷凍離心機上以2 000 r/min離心3 min甩干（洗滌和甩干過程注意避光操作）。甩干后的芯片置于避光盒中掃描備用，同一天掃描，避免熒光信號隨時間雜交信號延長而減弱。

1.4.7 芯片掃描及結果

將雜交后的芯片置于基因芯片掃描儀上，打開分析軟件GenePixPro4.0F進行圖像掃描。使用綠色 532 nm 單色熒光、100%Power Gain、10 μm 分辨率進行掃描，根據信號點的飽和程度調節PMT（光電倍增管）值，調節范圍在PMT550～PMT700。

2 結果

2.1 多重PCR擴增和基因芯片雜交圖譜

6種常見致病菌耐藥基因多重PCR擴增結果見圖1，圖中標記的各檢測基因行號與基因芯片點樣模式行號相對應，每管檢測6個基因，其具體每行對應的檢測基因情況可參見表1基因芯片點樣模式。基因芯片掃描結果見圖2，分別檢出的耐藥基因種類見表3，其中青霉素耐藥基因blaZ僅在肺炎克雷伯菌檢出，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌未檢出糖肽類耐藥基因，大腸埃希菌未檢出碳青霉素類耐藥基因。

圖1 6種常見致病菌耐藥基因多重PCR結果Figure1 Multiple PCR results of 6 common pathogenic bacteria resistance genes

圖2 耐藥基因芯片雜交圖譜結果Figure2 Results of drug-resistant gene chip hybridization

2.2 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，6種常見致病菌對頭孢類、四環素類、氯霉素類、喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素普遍耐藥，耐藥率在33.3%～92.3%之間；對糖肽類耐藥率較低，耐藥率均低于5%。6種細菌對大環內酯-林克酰胺-鏈陽菌素耐藥率在22.9%～71.9%之間；對甲氧芐啶和磺胺類耐藥率在12.1%～88.6%之間；對青霉素類耐藥率在10.5%～92.7%之間；對碳青霉素類耐藥率在1.8%～85.4%之間，見表4。

2.3 基因芯片與藥敏試驗符合率的比較

芯片檢測結果顯示，6種細菌的頭孢類、大環內酯-林克酰胺-鏈陽菌素、四環素類、氯霉素類、甲氧芐啶和磺胺類、糖肽類、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥基因陽性率與藥敏試驗結果基本一致，總符合率在90.9%～100%。除肺炎克雷伯菌外，其他5種細菌對青霉素類耐藥基因陽性率與藥敏試驗結果均存在差異。除大腸埃希菌外，其余5種細菌對碳青霉素類耐藥基因陽性率與藥敏試驗結果基本一致，總符合率在97.6%～100%（表5，表6）。

表3 6種常見致病菌檢出的耐藥基因種類Table3 The detection results of resistance genes in 6 common pathogenic bacteria

表4 6種常見致病菌藥敏試驗耐藥率[n（%）]Table4 Resistance rate of 6 common pathogenic bacteria by bacterial susceptibility test[n（%）]

表5 6種常見致病菌基因芯片檢測陽性率[n（%）]Table5 The positive rate of resistant genes in 6 common pathogenic bacteria by the gene chips[n（%）]

表6 6種常見致病菌藥敏試驗與基因芯片檢測結果總符合率（%）Table6 The total coincidence rate of bacterial susceptibility tests and gene chip detection data for 6 common pathogenic bacteria（%）

3 討論

6種常見致病菌的頭孢類、大環內酯-林克酰胺-鏈陽菌素、四環素類、氯霉素類、甲氧芐啶和磺胺類、糖肽類、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥基因陽性率與藥敏試驗結果基本一致，總符合率在90.9%～100%，說明該定制化的耐藥基因檢測芯片的檢測方法與傳統標準的藥敏檢測方法相比高度一致。金黃色葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單胞菌耐藥基因陽性率與藥敏試驗結果存在差異。而青霉素類耐藥基因blaZ僅在肺炎克雷伯菌中檢出，可能在設計上引物探針存在強偏好性，使得更傾向于檢測肺炎克雷伯菌，從側面也體現檢測該耐藥基因的引物探針對對其他細菌的檢測靈敏度不足。同樣的在舒麗紅和丁顯平[6]對基因芯片方法耐異煙肼結核分枝桿菌準確性的分析結果顯示，與傳統方法相比，基因芯片技術檢測敏感度、特異性為82%和97%，說明基因芯片技術在應用中有著靈敏度不足之處。但韓龍等[7]研發的基于醫院病原菌譜、可同時檢測10種病原菌和13種耐藥基因的檢測芯片，擁有著和PCR技術相當的靈敏度，說明雖然基因芯片在靈敏度有所欠缺，但并不能成為該技術的缺點。碳青霉類耐藥基因在大腸埃希菌中未檢出，與藥敏實驗結果不符，同樣的針對碳青霉類耐藥基因設計的檢測引物探針也存在靈敏度不足的原因，導致無法達到和藥敏實驗一樣的檢測限，造成檢測結果的假陰性，后續需要在設計上加大力度優化改進。

傳統的藥敏實驗，操作繁瑣、準確性低，且實驗周期往往需要2～3天，甚至更長時間。其他可代替藥敏實驗的技術，如多重PCR技術，雖快速準確，但存在反應相互影響、引物探針設計困難等問題[8-9]。全基因組測序可以發現幾乎所有細菌耐藥相關基因和元件，但對參比數據庫的要求非常嚴格，而目前國際上缺乏細菌耐藥基因的權威數據庫，且實驗過程繁瑣、價格高、通量低、分析耗時長。基因芯片技術是一種利用雜交原理，將大量的探針固定于固相表面，核酸樣本經熒光標記或擴增后，利用核酸雜交的特異性對大批量未知樣品進行檢測、分析的方法，具有高通量、高效、快速、準確的優勢[10-11]。例如 Perreten 等[12]開發的基因芯片可以檢測117種細菌耐藥基因，可同時檢測金黃色葡萄球菌的15種耐藥基因。雷向東等[13]發明的細菌耐藥基因檢測芯片，利用實時熒光PCR技術，2 h便可一次性檢測170種不同類別的耐藥性基因的190個靶點。

本研究針對ICU中常見、危害較大的6種常見致病菌，設計這些細菌對于10類抗生素的耐藥基因芯片，可快速準確獲得常見院感細菌的耐藥數據，適合在ICU等對時效性要求較高的臨床科室應用，可給臨床合理用藥帶來極大幫助。并為醫院及社區感染控制乃至細菌耐藥性流行病學調查及制定防治預案提供數據支持。另外，此平臺的搭建必將為臨床其他耐藥菌的基因芯片監測平臺的建立奠定基礎。

總之，常見細菌耐藥基因檢測芯片的建立及其應用充分說明，基因芯片與藥敏實驗的傳統檢測方法相比在準確性上高度符合且優勢明顯。但基因芯片的檢測技術也存在局限性，比如成品化芯片檢查耐藥基因固化與實際研究目的不一致，缺乏商品化的芯片自主研發耗時長、優化難度大、成本高等。這些都會制約該技術大規模推廣應用，需要更多科研人員的努力探索。