miR-21在黃芪甲苷保護ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥損傷過程中的作用

常方圓 馮澤瑞 許迎春 張秋霞

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是一種氧自由基攜帶者，也是公認的造成動脈粥樣硬化的獨立危險因子，可通過調(diào)控內(nèi)皮細胞通透性、誘導(dǎo)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)等使內(nèi)皮屏障功能降低，引起內(nèi)皮細胞損傷[1-3]；而血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化公認的始動環(huán)節(jié)。因此，如何保護血管內(nèi)皮免受包括炎癥在內(nèi)的細胞損傷，一直是動脈粥樣硬化研究的熱點。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗纖維化等作用[4]。近年來，黃芪甲苷在抗動脈粥樣硬化和在ox-LDL所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷中的保護作用已得到證實[5-6]，但其具體的作用機制并不完全明確。有研究指出，ox-LDL誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞中微小RNA（microRNA，miR）-21表達降低[7]，而黃芪甲苷被證實可通過上調(diào)miR-21表達促進心血管疾病的血管生成[8]。同時，采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-21與炎癥相關(guān)因子TLR4 3′UTR區(qū)域存在著互補的核苷酸序列。猜測miR-21可能通過靶向調(diào)控 Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）TLR4表達在黃芪甲苷保護ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥損傷過程中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究通過構(gòu)建ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）損傷模型，觀察黃芪甲苷減輕ox-LDL誘導(dǎo)誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷是否與miR-21有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

黃芪甲苷購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉雙抗和胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）購于廣州突源生物科技有限公司。噻唑藍（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑購于美國Sigma公司；脂質(zhì)體2000購于美國Invitrogen公司。miR-21模擬物、miR-21抑制劑及其相應(yīng)對照購于廣州銳博生物公司。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購于美國Millipore公司，抗人Toll樣受體4（toll-like receptor-4，TLR4）單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，鼠抗人β肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購于北京康為世紀生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠IgG抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，pmirGLO載體購于深圳市偉通生物科技有限公司，Trizol試劑和二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）ELISA試劑盒購于上海雙贏生物科技有限公司，熒光素酶檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)來自于上海中喬新舟科技公司的HUVEC。將對數(shù)生長期的HUVEC隨機分為對照組（未干預(yù)）、模型組（100 μmol/L ox-LDL作用24 h）、治療-低劑量（L）組、治療-中劑量（M）組和治療-高劑量（H）組，其中治療-L、M和H組細胞先加入100 μmol/L ox-LDL作用24 h后，再分別以10、20和40 mg/L的黃芪甲苷作用2 h。后期將對數(shù)生長期的HUVEC分為模型組、miR-NC組、miR-21組、anti-miR-NC組和anti-miR-21組，采用脂質(zhì)體法將miR-21模擬物陰性對照miR-NC、miR-21模擬物、miR-21抑制劑陰性對照anti-miR-NC和miR-21抑制劑參照脂質(zhì)體2000說明書步驟分別轉(zhuǎn)染至miR-NC組、miR-21組、anti-miR-NC組和anti-miR-21組細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后以100 μmol/L ox-LDL作用24 h，觀察miR-21過表達或低表達對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷的影響。另外，設(shè)置模型組、治療組（ox-LDL干預(yù)后給予40 mg/L的黃芪甲苷作用）和治療+anti-miR-21組（轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，分別以ox-LDL和40 mg/L的黃芪甲苷干預(yù)），觀察miR-21低表達對黃芪甲苷作用下HUVEC炎癥因子的影響。

1.3 MTT法檢測HUVEC存活率

向黃芪甲苷和ox-LDL處理結(jié)束后的各組細胞以及不含細胞只有培養(yǎng)基的空白孔中加入5 g/L MTT溶液10 μL，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入二甲基亞楓150 μL溶解MTT晶體。采用酶標儀在490 nm波長處測定各組細胞光密度（optical density，OD）值，計算各組細胞的存活率。計算公式：存活率（%）=（實驗孔OD-空白孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.4 ELISA法檢測HUVEC上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量

將對數(shù)生長期的HUVEC以適當(dāng)密度接種至10 cm的培養(yǎng)皿中，按照對照組、模型組、治療-L組、治療-M組、治療-H組的分組處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，轉(zhuǎn)移至離心管中，以1 000 r/min離心5 min，收集上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測TNF-α、IL-6和NF-κB含量。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 HUVEC中miR-21和TLR4 mRNA的表達

使用Trizol試劑抽提各組HUVEC總RNA，并采用超微量紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)上海生工生物工程有限公司合成的miR-21引物（上游：5′-GCGCGCTAGCTTATCAAGCTGATG-3′，下游：5′-GTGCAGGCTCCGAGGT-3′）、U6 引物（上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 ：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）、β-actin引物（上游：5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′，下游：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′）和TLR4引物（上游 5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′）進行 PCR 擴增，PCR 反應(yīng)條件如下：94℃ 10 min，94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s循環(huán)35次。以U6和β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算 HUVEC 中 miR-21 和 TLR4 mRNA的表達。

1.6 Western blot檢測HUVEC中TLR4蛋白的表達

胰蛋白酶消化收集各組HUVEC，加入細胞裂解液提取各組細胞總蛋白。采用BCA法對總蛋白定量后，以等體積上樣換液與待測樣品蛋白混勻，沸水浴變性5 min。取變性蛋白以每孔80 μg上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠孔中行電泳分離。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1.5 h后，分別以一抗（1∶500）4℃孵育過夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。電化學(xué)（electrochem-iluminescence，ECL）法顯影后，采用凝膠成像分析Quantity one軟件進行灰度分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-21和TLR4的靶向關(guān)系

采用TargetScan生物學(xué)信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-21與TLR4 3′UTR存在互補的核苷酸序列。為了證實miR-21與TLR4是否存在靶向關(guān)系，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建野生型（WT-TLR4）和突變型（MUT-TLR4）的 TLR4的3′-UTR熒光素酶報告載體，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟行miR-NC+WT-TLR4、miR-21（miR-21模擬物）+WT-TLR4、miR-NC+MUT-TLR4、miR-21+MUT-TLR4轉(zhuǎn)染，于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細胞，根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的熒光素酶的活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）形式表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對HUVEC內(nèi)炎癥因子分泌的影響

與對照組相比，模型組、治療-L組、治療-M組和治療-H組細胞的存活率顯著降低，而炎癥因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療-L組、治療-M組和治療-H組細胞存活率顯著升高，而TNF-α、IL-6和NF-κB含量顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性，見表1。

表1 黃芪甲苷對HUVEC內(nèi)炎癥因子分泌的影響Table1 Effect of astragaloside IV on secretion of inflammatory factors in HUVEC

2.2 黃芪甲苷對HUVEC內(nèi)miR-21和TLR4表達的影響

與對照組相比，模型組、治療-L組、治療-M組和治療-H組細胞內(nèi)miR-21表達水平均顯著降低，而TLR4 mRNA和蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療-L組、治療-M組和治療-H組細胞內(nèi)miR-21表達水平表達水平均依次顯著升高，而TLR4 mRNA和蛋白表達水平均依次降低（P＜0.05）。見表2和圖1。

2.3 miR-21與TLR4靶向關(guān)系的驗證

生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TLR4 3′UTR存在能夠與miR-21互補的結(jié)合位點，結(jié)果見表3。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與miR-NC+TLR4-WT組相比，miR-21過表達miR-21+TLR4-WT組細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而 miR-NC+TLR4-MUT 組和 miR-21+TLR4-MUT組間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表2 黃芪甲苷對HUVEC內(nèi)miR-21和TLR4表達的影響Table2 Effect of astragaloside IV on the expression of miR-21 and TLR4 in HUVEC

2.4 miR-21對HUVEC內(nèi)炎癥因子分泌和TLR4表達的影響

與模型組相比，miR-NC組和anti-miR-NC組細胞的存活率、細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB含量和TLR4 mRNA的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但是，與模型組相比，miR-21組細胞存活率升高、細胞內(nèi)TNF-α、IL-6和NF-κB含量以及TLR4 mRNA、蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05），而anti-miR-21組細胞存活率升高且細胞內(nèi) TNF-α、IL-6和 NF-κB 含量以及 TLR4 mRNA、蛋白的表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見表5和圖2。

圖1 Western blot檢測黃芪甲苷對TLR4蛋白表達的影響Figure1 The effect of astragaloside IV on the expression of TLR4 protein was detected by Western blot

2.5 下調(diào)miR-21表達對HUVEC炎癥因子分泌的影響

與模型組相比，治療組、治療+anti-miR-NC組和治療+anti-miR-21組細胞存活率顯著升高，而細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、NF-κB 含量和TLR4 mRNA、蛋白的表達均顯著降低（P＜0.05）；與治療組相比，治療+antimiR-21組細胞存活率顯著降低，細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、NF-κB 含量和TLR4 mRNA、蛋白的表達均顯著升高（P＜0.05）；而治療+anti-miR-NC組與治療組相比無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表6和圖3。

表3 TLR4 3′UTR與miR-21的結(jié)合位點Table3 Binding sites of TLR4 3′UTR and miR-21

表4 各組HUVEC熒光素酶活性的比較Table4 Comparison of luciferase activities in HUVEC

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性血管疾病，炎癥反應(yīng)存在與動脈粥樣硬化的各個階段。越來越多的證據(jù)顯示，ox-LDL通過調(diào)控NF-κB/TNF-α信號通路等誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的重要機制[9-11]。本研究以ox-LDL刺激HUVEC后檢測得到促炎相關(guān)因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量均顯著升高，且細胞存活率降低，這表明ox-LDL成功誘導(dǎo)HUVEC出現(xiàn)炎癥損傷。

黃芪甲苷又稱黃芪皂苷IV，是黃芪皂苷中的主要成分，具有抗氧、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。Qin等[12]指出，黃芪甲苷可通過調(diào)控SDF-1/CXCR4生物軸下調(diào)甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和上調(diào)高密度脂蛋白膽固醇水平發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。馬海濤等[13]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路逆轉(zhuǎn)過氧化氫對HUVEC增殖和凋亡的調(diào)控改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUVEC損傷。You等[14]研究證實，黃芪甲苷對高葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷具有顯著的保護作用，其作用機制與抑制JNK信號通路促進細胞增殖、減少凋亡并降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達有關(guān)。上述研究表明，黃芪甲苷在改善動脈粥樣硬化和改善血管內(nèi)皮損傷方面的具有較好

的作用。本研究以10、20和40 mg/L的黃芪甲苷作用HUVEC后發(fā)現(xiàn)，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷得到顯著改善。該結(jié)果與魏冰等[6]得到的黃芪甲苷具有保護ox-LDL所致血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷的結(jié)果相似。結(jié)果表明，黃芪甲苷可改善ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷。

表5 miR-21對HUVEC內(nèi)炎癥因子分泌和TLR4表達的影響Table5 Effect of miR-21 on inflammatory factor secretion and TLR4 expression in HUVEC

表6 下調(diào)miR-21表達對黃芪甲苷刺激下HUVEC炎癥因子分泌的影響Table6 Effect of down-regulation of miR-21 expression on secretion of inflammatory cytokines in HUVEC stimulated by astragaloside

圖2 Western blot檢測miR-21對TLR4蛋白表達的影響Figure2 The effect of miR-21 on the expression of TLR4 protein was detected by Western blot

圖3 Western blot檢測下調(diào)miR-21對黃芪甲苷刺激下TLR4蛋白表達的影響Figure3 Down-regulation of miR-21 on the expression of TLR4 protein stimulated was detected by Western blot

TLR4是Toll樣受體家族成員，可通過調(diào)控下游NF-κB及炎性因子在炎癥與免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[15-17]。Tian 等[18]研究以及蔡謙謙等[19]研究均證實TLR4在ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC炎癥損傷過程中發(fā)揮著重要的促進作用。Tang等[7]研究指出，ox-LDL可降低miR-21表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致人主動脈內(nèi)皮細胞損傷；而miR-21過表達可消除ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷。Ma等[20]發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)中，miR-21靶向抑制TLR4表達。這些研究顯示miR-21和TLR4在主動脈內(nèi)皮細胞炎癥損傷過程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過TargetScan軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實TLR4是miR-21的潛在靶基因。為了進一步探討黃芪甲苷改善ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷的分子機制，本研究進一步檢測發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可呈濃度依賴性降低ox-LDL誘導(dǎo)的TLR4表達，并升高miR-21表達。這與Yu等[8]報道的黃芪甲苷可通過上調(diào)miR-21表達促進心血管疾病的血管生成的機制部分一致。另外，本研究下調(diào)miR-21表達可逆轉(zhuǎn)黃芪甲苷對HUVEC炎癥損傷的保護作用。結(jié)果提示，上調(diào)miR-21靶向抑制TLR4表達是黃芪甲苷減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷的重要機制。

綜上所述，黃芪甲苷可通過調(diào)控miR-21靶向抑制TLR4表達減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥損傷。本研究僅從細胞水平揭示了黃芪甲苷改善HUVEC炎癥損傷的部分機制，后期工作將從動物水平上進行驗證，以期為黃芪甲苷抗動脈粥樣硬化的治療提供新的實驗依據(jù)。