miR-548c-3p通過(guò)調(diào)控TRIM59表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

年士艷 馮磊

肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱肝癌，hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界發(fā)病率第6高的癌癥[1]。在中國(guó)，肝癌是第四大常見(jiàn)惡性腫瘤，致死率位居腫瘤第三位[2]，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。外科手術(shù)（切除、肝移植）、局部切除（消融和栓塞治療）和放療、全身治療等是其主要治療方法[3]，但5年生存率仍然低于5%[4]。研究肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為肝癌的分子診斷和治療提供新的靶點(diǎn)，對(duì)臨床來(lái)說(shuō)尤其重要。

大量研究表明，miR-548c-3p在乳腺癌細(xì)胞[5]、膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞[6]及骨肉瘤組織和細(xì)胞[7]中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)或上調(diào)miR-548c-3p可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，或促進(jìn)凋亡。三基序蛋白 59（tripartite motif containing 59，TRIM59）在肝癌組織[8]、骨肉瘤組織和細(xì)胞[9]中表達(dá)上調(diào)，其過(guò)表達(dá)與肝癌惡性進(jìn)展和患者預(yù)后密切相關(guān)，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TRIM59在膀胱癌組織和細(xì)胞[10]及膠質(zhì)瘤細(xì)胞[11]中高表達(dá)，干擾或抑制TRIM59表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及克隆形成能力。但miR-548c-3p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肝癌影響，其與TRIM59在肝癌中的關(guān)系目前還尚不明確。本課題研究miR-548c-3p影響肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的分子機(jī)制，以及TRIM59在此機(jī)制中的作用，以期為肝癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和人正常肝細(xì)胞株L02購(gòu)自美國(guó)ATCC；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；牛血清白蛋白（Bovine Serun Albumin，BSA）、胰蛋白酶 Trypsin、二甲基亞礬（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氮唑藍(lán)（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT）購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司；Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；抗TRIM59抗體、抗CyclinD1抗體、抗p21抗體、抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；引物、miR-548c-3p模擬物（miR-548c-3p）、miR-548c-3p抑制劑（anti-miR-548c-3p）、TRIM59的過(guò)表達(dá)載體（pcDNATRIM59）、TRIM59干擾物（si-TRIM59）、空載體和陰性對(duì)照（pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC和si-NC）及雙熒光載體的構(gòu)建購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System）購(gòu)自美國(guó) Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；顯微鏡、發(fā)光儀、酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞。培養(yǎng)條件：在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度恒定在37℃，飽和濕度。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，顯微鏡觀察，消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2稀釋至1×l06個(gè)細(xì)胞/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無(wú)血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和各組片段及載體（包括miR-548-3p過(guò)表達(dá)組：miR-548c-3p組和miR-NC組、TRIM59抑制組：si-NC組和si-TRIM59組、miR-548-3p抑制組：anti-miR-548c-3p組和anti-miR-NC組、miR-548-3p和TRIM59同時(shí)過(guò)表達(dá)組：miR-548-3p+pcDNA組和miR-548-3p+pcDNA-TRIM59組、雙熒光載體組），之后將稀釋的等體積脂質(zhì)體和各組載體片段輕柔混勻，室溫孵育20 min，將混合液滴入到培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞中，輕柔混勻，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)

收集正常肝細(xì)胞和各組肝癌細(xì)胞，根據(jù)Total RNA提取試劑盒的要求提取細(xì)胞總RNA，在-80℃下保存。然后以RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板按照real-time PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 30 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。運(yùn)用 Bio-Rad PCR 系統(tǒng)，2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，Trypsin消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×104個(gè)/mL，2×103個(gè)/孔接種于96微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)液，再在每孔加入150 μL DMSO，室溫混勻5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm吸光度（A）值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的各組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，加入含1%BSA的無(wú)血清RPIM-1640培養(yǎng)基，稀釋細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/mL。在 Transwell下層小室加入 500 μL含10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)基作為遷移趨化物，上層小室中加入100 μL稀釋好的細(xì)胞，將上層小室放入下層小室中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽拭去上層小室的細(xì)胞，冰甲醛固定遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

侵襲實(shí)驗(yàn)：用4℃無(wú)血清培養(yǎng)基1∶8比例稀釋Matrigel，加入上層小室，37℃3 h烘干，以下步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，上層小室加入100 μL細(xì)胞，下層加入500 μL含10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染48 h的HepG2細(xì)胞，消化，稀釋，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，按照1.2.2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的TRIM59的野生型（WT-TRIM59）和突變型（MUT-TRIM59）雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-NC或miR-548c-3p共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，用裂解緩沖液室溫裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素相對(duì)酶活性。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

將L02細(xì)胞和轉(zhuǎn)染48 h后的各組HepG2細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，超聲破碎細(xì)胞收蛋白并檢測(cè)濃度。將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗，抗 TRIM59抗體（1∶1 000）、抗 CyclinD1抗體（1∶2 000）、抗 p21抗體（1∶1 500）、抗MMP-2抗體（1∶1 500）、抗MMP-9抗體（1∶2 000）和抗GAPDH抗體（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜2次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-548c-3p和TRIM59在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞L02相比，在肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402組中TRIM59的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-548c-3p的表達(dá)量則均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1和表1。TRIM59和miR-548c-3p在3個(gè)肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況一致，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究。

2.2 miR-548c-3p過(guò)表達(dá)可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與miR-NC組相比，miR-548c-3p組HepG2細(xì)胞中的miR-548c-3p表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），p21顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞在48 h和72 h增殖活性顯著降低（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2和表2。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-548c-3p可以抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖1 TRIM59在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)Figure1 Expression levels of TRIM59 in hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cells

表1 miR-548c-3p和TRIM59在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=12）Table1 Expression levels of miR-548c-3p and TRIM59 in hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cells（±s，n=12）

表1 miR-548c-3p和TRIM59在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=12）Table1 Expression levels of miR-548c-3p and TRIM59 in hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cells（±s，n=12）

與L02組比較，*P＜0.05

分組L02 HepG2 SMMC-7721 BEL-7402 F值P值miR-548c-3p 1.01±0.09 0.38±0.03*0.51±0.05*0.46±0.04*297.771 0.000 TRIM59 mRNA 0.98±0.09 3.02±0.29*2.78±0.27*2.91±0.28*184.199 0.000 TRIM59蛋白0.19±0.02 0.54±0.05*0.63±0.06*0.58±0.06*190.257 0.000

圖2 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure2 Expression of proteins related to proliferation，migration and invasion

2.3 抑制TRIM59表達(dá)可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-NC組相比，si-TRIM59組HepG2細(xì)胞中TRIM59蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），p21顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞在48 h和72 h增殖活性顯著降低（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3和表3。說(shuō)明抑制TRIM59可抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

表2 miR-548c-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=6）Table2 Effects of miR-548c-3p overexpression on proliferation，migration and invasion of HepG2 cells（±s，n=6）

表2 miR-548c-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=6）Table2 Effects of miR-548c-3p overexpression on proliferation，migration and invasion of HepG2 cells（±s，n=6）

與miR-NC組比較，*P＜0.05

分組miR-NC miR-548c-3p t值P值miR-548c-3p 1.00±0.09 2.76±0.27*15.148 0.000細(xì)胞活性（OD490nm）24 h 0.39±0.04 0.37±0.03 0.980 0.350 48 h 0.73±0.07 0.49±0.04*7.292 0.000 72 h 1.16±0.09 0.64±0.06*11.776 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）102.36±9.54 46.51±5.01*12.696 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）82.41±8.22 32.41±5.12*12.647 0.000 CyclinD1蛋白0.71±0.07 0.32±0.03*12.544 0.000 p21蛋白0.28±0.03 0.66±0.06*10.096 0.000 MMP-2蛋白0.61±0.06 0.27±0.03*12.415 0.000 MMP-9蛋白0.65±0.06 0.23±0.03*15.336 0.000

2.4 miR-548c-3p靶向調(diào)控TRIM59的表達(dá)

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TRIM59的3′-UTR序列中含有與miR-548c-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖4A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表4所示，與miR-NC組相比，miR-548c-3p組野生型WTTRIM59的螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性顯著下降（P<0.05）；而突變型MUT-TRIM59的螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性沒(méi)有明顯變化。Western blot結(jié)果表明，與miR-NC組相比，miR-548c-3p組的TRIM59蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；與 anti-miR-NC 組相比，anti-miR-548c-3p組的TRIM59蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），見(jiàn)圖4B和表5。

2.5 TRIM59過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-548c-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

圖3 TRIM59和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of TRIM59 and proteins related to proliferation，migration and invasion

與miR-NC組相比，miR-548c-3p組的TRIM59蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），p21顯著上升（P＜0.05），HepG2細(xì)胞在48 h和72 h增殖活性顯著降低（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9顯著下降（P＜0.05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降（P＜0.05）；與miR-548c-3p+pcDNA組相比，miR-548c-3p+pcDNA-TRIM59組TRIM59蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著升高（P＜0.05），p21顯著降低（P＜0.05），HepG2細(xì)胞在48 h和72 h增殖活性顯著上升（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9顯著增多（P＜0.05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著上升（P＜0.05）。說(shuō)明過(guò)表達(dá)TRIM59逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-548c-3p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

表3 抑制TRIM59表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=6）Table3 Effect of TRIM59 inhibition on proliferation，migration and invasion of HepG2 cells（±s，n=6）

表3 抑制TRIM59表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=6）Table3 Effect of TRIM59 inhibition on proliferation，migration and invasion of HepG2 cells（±s，n=6）

與si-NC組比較，*P＜0.05

分組si-NC si-TRIM59 t值P值TRIM59 0.59±0.05 0.22±0.03*15.543 0.000細(xì)胞活性（OD490nm）24 h 0.41±0.04 0.39±0.03 0.980 0.350 48 h 0.75±0.07 0.56±0.05*5.410 0.000 72 h 1.18±0.09 0.73±0.06*10.191 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）113.45±10.28 56.38±5.58*11.951 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）89.24±8.24 44.68±4.07*11.877 0.000 CyclinD1蛋白0.73±0.07 0.39±0.04*10.330 0.000 p21蛋白0.26±0.03 0.53±0.05*11.342 0.000 MMP-2蛋白0.63±0.06 0.34±0.03*10.589 0.000 MMP-9蛋白0.67±0.06 0.32±0.03*12.780 0.000

圖4 miR-548c-3p靶向調(diào)控TRIM59的表達(dá)Figure4 miR-548c-3p targets and regulates the expression of TRIM59

表4 雙熒光素酶報(bào)告的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）Table4 Dual luciferase reporter assay（±s，n=6）

表4 雙熒光素酶報(bào)告的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）Table4 Dual luciferase reporter assay（±s，n=6）

與miR-NC組比較，*P＜0.05

分組miR-NC miR-548c-3p t值P值WT-TRIM59 1.02±0.09 0.40±0.04*15.420 0.000 MUT-TRIM59 1.01±0.08 0.98±0.09 0.610 0.555

3 討論

盡管肝癌治療方法有極大的改進(jìn)和提高[12]，中晚期患者的治療效果仍然很差。

研究表明，miRNA參與肝癌的發(fā)生，并與肝癌的診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后及生存率評(píng)估有關(guān)[13-14]。miR-548c-5p在乳腺癌復(fù)發(fā)患者中表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)于縮短總生存期有關(guān)[15]。Chang 等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-548c-3p在幽門(mén)螺桿菌陰性胃癌腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，與胃癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Habieb等[17]最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-548-a-3p在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，與lncRNA-TSIX和SOGA1一起是肝癌的潛在診斷標(biāo)志物，在區(qū)分肝癌患者與丙型肝炎患者和健康對(duì)照組方面顯示出了很高的敏感性和特異性。miR-548c-3p在肝癌中的表達(dá)尚不清楚。本研究結(jié)果表明，與人正常肝細(xì)胞L02相比，miR-548c-3p在肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402中表達(dá)均顯著下調(diào)，與Habieb等研究結(jié)果類似，過(guò)表達(dá)miR-548c-3p可抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，證實(shí)了miR-548c-3p在肝癌發(fā)展中的作用。

表5 miR-548c-3p調(diào)控TRIM59的表達(dá)（±s，n=12）Table5 miR-548c-3p regulates the expression of TRIM59 in HepG2 cells（±s，n=12）

表5 miR-548c-3p調(diào)控TRIM59的表達(dá)（±s，n=12）Table5 miR-548c-3p regulates the expression of TRIM59 in HepG2 cells（±s，n=12）

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05

分組miR-NC miR-548c-3p anti-miR-NC anti-miR-548c-3p F值P值TRIM59蛋白0.53±0.05 0.23±0.03*0.51±0.06 0.93±0.09#263.629 0.000

圖5 TRIM59和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure5 Expression levels of TRIM59 and proteins related to proliferation，migration and invasion in HepG2 cells

表6 TRIM59過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-548c-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=12）Table6 Overexpression of TRIM59 reversed the effects of miR-548c-3p overexpression on proliferation，migration and invasion in HepG2 cells（±s，n=12）

表6 TRIM59過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-548c-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=12）Table6 Overexpression of TRIM59 reversed the effects of miR-548c-3p overexpression on proliferation，migration and invasion in HepG2 cells（±s，n=12）

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-548c-3p+pcDNA組比較，#P＜0.05

分組p21蛋白miR-NC miR-548c-3p miR-548c-3p+pcDNA miR-548c-3p+pcDNA-TRIM59 F值P值TRIM59蛋白0.54±0.05 0.21±0.03*0.18±0.02 0.42±0.04#263.333 0.000細(xì)胞活性（OD490 nm）24 h 0.40±0.04 0.37±0.03 0.36±0.03 0.38±0.04 2.800 0.051 48 h 0.73±0.06 0.48±0.04*0.45±0.04 0.61±0.06#76.423 0.000 72 h 1.17±0.09 0.61±0.06*0.58±0.05 0.88±0.08#176.621 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）106.58±9.64 43.65±4.21*40.59±4.17 81.66±8.24#246.539 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）84.24±8.07 35.42±3.17*32.98±3.33 67.24±6.56#231.784 0.000 CyclinD1蛋白0.71±0.07 0.33±0.03*0.31±0.03 0.56±0.05#192.478 0.000 0.29±0.03 0.62±0.06*0.64±0.06 0.41±0.04#141.526 0.000 MMP-2蛋白0.63±0.06 0.25±0.03*0.22±0.02 0.47±0.05#243.189 0.000 MMP-9蛋白0.62±0.06 0.28±0.03*0.26±0.02 0.51±0.05#201.676 0.000

此外，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM59的3′-UTR序列中含有與miR-548c-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-548c-3p與TRIM59之間可能存在調(diào)控關(guān)系，假設(shè)TRIM59在肝癌中參與miR-548c-3p對(duì)肝癌的調(diào)控過(guò)程。

TRIM59是三基序家族TRIM蛋白家族成員之一，位于3號(hào)染色體上，因具有RING結(jié)構(gòu)被歸為泛素連接酶，在肝癌、肺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，具有致癌基因的作用[18]。Sun 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，TRIM59表達(dá)量顯著高于人正常肝細(xì)胞，敲除TRIM59可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而過(guò)度表達(dá)TRIM59可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，TRIM59的沉默降低了E-cadherin的表達(dá)，增加了N-cadherin和波形蛋白的表達(dá)，而TRIM59的過(guò)表達(dá)對(duì)上述蛋白的影響相反，p53蛋白表達(dá)水平受TRIM59調(diào)控，TRIM59可能通過(guò)p53信號(hào)通路促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，TRIM59可能是治療肝細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究證實(shí)，TRIM59在肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402組中mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高，抑制TRIM59可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與Sun G等研究結(jié)果一致，證實(shí)了TRIM59在肝癌發(fā)展中具有重要作用。

本研究通過(guò)Western blot和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-548c-3p靶向負(fù)調(diào)控TRIM59的表達(dá)，過(guò)表達(dá)TRIM59逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-548c-3p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，證實(shí)了在肝癌中miR-548c-3p和TRIM59之間具有調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了在肝癌HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-548c-3p可靶向抑制TRIM59的表達(dá)，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-548c-3p和TRIM59有望成為肝癌診斷和治療的分子靶點(diǎn)，為肝癌的診斷和治療提供新的研究方向。

下一步將對(duì)肝癌患者血清或血漿等樣本進(jìn)行進(jìn)一步的研究，確定miR-548c-3p和TRIM59在肝癌診斷中的價(jià)值。