細胞免疫聯(lián)合手術(shù)對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者生存質(zhì)量的影響

許立國 馮廣森 林亞超 李智

肝臟是結(jié)直腸癌最常見血行散播靶器官。約50%結(jié)直腸癌患者在初診時出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，約15%～25%患者在病程中出現(xiàn)異時性肝轉(zhuǎn)移，其中80%肝轉(zhuǎn)移患者肝轉(zhuǎn)移灶不能獲得根治性切除，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因[1]。因此如何預(yù)防、治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移成為臨床研究熱點。近年來過繼免疫療法治療惡性腫瘤逐漸受到人們關(guān)注尤其是晚期癌癥[2]。樹突狀細胞-細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（dendritic cell-cytokine-induced killer，DCCIK）免疫技術(shù)是一種細胞生物免疫治療技術(shù)，它利用樹突狀細胞與細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞定向精準殺傷腫瘤[3]。氬氦刀冷凍消融術(shù)是一種局部超低溫冷凍消融腫瘤微創(chuàng)類先進醫(yī)療技術(shù)，能通過冷凍+熱療消除腫瘤[4]。本研究選取結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，從全血T淋巴細胞亞群、血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平及生存質(zhì)量等角度，觀察DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)應(yīng)用價值，為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療提供參考，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年3月本院收治的68例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，簡單隨機劃分為對照組（34例）和觀察組（34例），兩組年齡、病程、腫瘤最大直徑、性別、體質(zhì)量指數(shù)、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)量、原發(fā)病類型、轉(zhuǎn)移類型、臨床分期、病理分型、分化程度、合并疾病等資料均衡可比（P>0.05），見表1。本研究患者均自愿簽署知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會審核批準。

1.2 納入標準及排除標準

（1）納入標準：無腹水、黃疸、出血傾向；符合結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷標準[5]；無其他臟器轉(zhuǎn)移及肝功能衰竭；自愿簽署知情同意書；（2）排除標準：存在其他原發(fā)性惡性腫瘤者；合并嚴重病毒、細菌感染者；存在生物制品過敏史及自身免疫疾病者；存在藥物無法控制高血壓者；合并急性心腦血管疾病者；伴有傳染類疾病者。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑/儀器

anti-CD3單克隆抗體（Peprotech公司，美國）；GT-T551培養(yǎng)基（TaKaRa公司，日本）；重組人干擾素 γ（rh IFN-γ）（Novoprotein 公司）；Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液（GE Healthcare公司，美國）；重組人白介素-4（recombinant human Interleukin-4，rh IL-4）（Peprotech公司，美國）；重組人腫瘤壞死因子（recombinant human tumor necrosis factor-α，rh TNF-α）（Peprotech公司，美國）；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）（Peprotech公司，美國）；重組人白介素-1α（recombinant human interleukin-1α，rh IL-1α）（Sinobiological公司）；重組人白介素-2（recombinant human interleukin-2，rh IL-2）（北京四環(huán)生物制藥有限公司）；血細胞分離機（南京惠杰醫(yī)療科技有限公司）；電子計算機斷層掃描機（computed Tomography，CT）（中國新博醫(yī)療技術(shù)有限公司）；冷凍消融系統(tǒng)（Galil Medical Ltd。公司，以色列）。

表1 兩組臨床資料對比Table1 Comparison of clinical data between two groups

1.3.2 對照組治療方法

對照組予以CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)。（1）術(shù)前：實施CT定位掃描，整體評估手術(shù)可行性，明確進針數(shù)量、方向、冷凍范圍、路徑等，設(shè)計包含3、2、5 mm在內(nèi)多種組合，以單刀或多刀組合方式進行穿刺，腫瘤組織盡可能全部被冰球包容，冷凍范圍＞腫瘤邊緣1.0 cm，穿刺路徑設(shè)計時注意重要神經(jīng)與大血管。（2）手術(shù)方法：3.0T CT機，根據(jù)穿刺路徑要求取合適體位實施CT掃描，再次明確進針方向、進針點，測量進針距離，標記定位腫瘤相應(yīng)皮膚表面，常規(guī)消毒鋪巾、局部浸潤麻醉，CT引導(dǎo)下按預(yù)定路徑插入氬氦刀至目標深度。核實無誤后，開啟氬氦靶向治療系統(tǒng)冷凍消融系統(tǒng)按40%氬氣輸出功率超低溫快速冷凍，維持-140℃～-160℃溫度15 min，啟動氦氣升溫至20℃，再啟動超低溫快速冷凍，共重復(fù)2個循環(huán)，氬氦刀超導(dǎo)探頭可拔動時退刀，再次實施CT掃描，觀察冷凍效果、是否有出血等情況，穿刺通道止血，對應(yīng)部位皮膚進行消毒、包扎。（3）術(shù)后囑患者定期隨訪。

1.3.3 觀察組治療方法

觀察組予以DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)（方法同對照組）。消融術(shù)實施DC-CIK細胞免疫：（1）先按流程制備DC-CIK細胞，確定細菌、真菌檢驗結(jié)果陰性，抽樣5 mL，臺盼藍染色，觀察計數(shù)活細胞與死細胞數(shù)量，并檢測明確內(nèi)毒素陰性，收集24瓶細胞，置于無菌離心瓶內(nèi)，離心8 min后棄去上清，0.9%注射用水平衡細胞，離心清晰，棄去上清，收集細胞至注射用生理鹽水中（0.9%，100 mL），注入50%5 mL人血白蛋白，混勻后抽樣1 mL置于-4℃以備測。（2）核對患者信息，無誤后進行回輸，1個月1次，共回輸3次。

1.4 療效評定

參照實體瘤療效評判標準[6]分為4個等級。完全緩解（complete response，CR）：病灶消失，維持4周以上；部分緩解（partial remission，PR）：病灶減少≥50%，維持4周以上；穩(wěn)定（stable disease，SD）：病灶減少＜50%或增大＜25%，無新發(fā)病灶，維持4周以上；進展（progressive disease，PD）：病灶增大≥25%。緩解率=（CR+PR）/總例數(shù)×100%。

1.5 觀察指標

1.5.1 標本采集與檢測

采集EDTA抗凝靜脈血2 mL，以流式細胞儀檢測全血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）水平；采集靜脈血3 mL，4 000 r/min離心10 min分離血清，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清糖類抗原242（carbohydrate antigen 242，CA242）、CEA、糖類抗原 199（carbohydrate antigen 199，CA199）水平；取500 μL血清樣本，以Trizol法提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cRNA，以U6小核RNA為內(nèi)參照，以cRNA為模板，設(shè)計內(nèi)參U6上下游引物分別為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，微小 RNA（miR）-21上下游引物分別為5′-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′、5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，miR-106a 上下游引物分別為 5′-GCGGCGGAAAAGTGCTTACAGTG-3′、5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，以熒光定量PCR檢測miR-21、miR-106a表達，反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)緩沖液10 μL、引物 1 μL、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1.33 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶2.5 U，應(yīng)用無酶水補充至25 μL，混合液稍離心后立即置于PCR儀上，執(zhí)行擴增，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性15 min、94℃變性15 s、55℃ 30 s、70℃ 34 s，共40個循環(huán)，最后在72℃保溫7 min，OCR產(chǎn)物放置4℃下電泳檢測。

1.5.2 觀察指標

（1）比較兩組術(shù)后3個月緩解率。（2）比較兩組術(shù)前、術(shù)后3個月T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）水平。（3）比較兩組術(shù)前、術(shù)后3個月CA242、CEA、CA199水平。（4）比較兩組術(shù)前、術(shù)后3個月miR-21、miR-106a表達量。（5）比較兩組術(shù)前、術(shù)后3個月生存質(zhì)量：以歐洲癌癥研究治療組織研發(fā)癌癥患者生存質(zhì)量評定量表（European Organisation for Research and Treatment Cancer Quality of Life-C30，EORTC QLQ-C30）[3]，分為 5 個功能量表（包含2個條目認知功能量表、2個條目社會功能量表、4個條目情緒功能量表、5個條目軀體功能量表、2個條目角色功能量表）、1個整體生活質(zhì)量量表（2個條目）、3個癥狀量表（包含2個條目惡心嘔吐量表、2個條目疼痛量表、3個條目疲乏量表）、6個單項測量項目，共30個條目，整體生活質(zhì)量量表分為1（最低生活質(zhì)量）～7級（最高生活質(zhì)量），功能量表評分分為1（最低功能）～4級（最高功能），其他條目分為1～4級，整體生活質(zhì)量量表、功能量表評分越高，質(zhì)量或功能越佳，癥狀量表、單項測試項目評分越高，對應(yīng)測試條目越嚴重。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以表示，以t檢驗，計數(shù)資料用n（%）表示，以χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較

觀察組術(shù)后3個月CR、PR、SD、PD分別有3、13、11、2例，緩解率為 61.76%；對照組 CR、PR、SD、PD分別有 3、4、19、8例，緩解率為20.59%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。單個病例術(shù)前、術(shù)后3個月肝臟CT圖見圖1。

表2 兩組療效比較[n（%）]Table2 Comparisons of curative effects between the two groups[n（%）]

患者性別男，59歲，圖1A為其術(shù)前肝臟CT圖像，可見面積較大癌灶，經(jīng)DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)治療后3個后癌灶面積明顯減小，見圖1B。

2.2 兩組血清T淋巴細胞亞群比較

觀察組術(shù)后 3 個月 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3 兩組CA242、CEA、CA199水平比較

觀察組術(shù)后3個月CA242、CEA、CA199低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.4 兩組miR-21、miR-106a表達比較

觀察組術(shù)后3個月miR-21、miR-106a表達量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表5。

2.5 兩組EORTC QLQ-C30評分比較

觀察組術(shù)后3個月功能量表、整體生活質(zhì)量量表評分高于對照組，癥狀量表、單項測試項目評分低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表6。

3 討論

CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)是近年來發(fā)展起來冷凍治療技術(shù)，能用于多種腫瘤治療，尤其適用于不能耐受手術(shù)或不能手術(shù)切除患者，其主要通過能迅速降溫的氬氣，封閉腫瘤形成冰晶，促使癌細胞脫水、破裂，再利用能迅速升溫的氦氣，融化冰晶，促使癌灶發(fā)生腫脹、破裂。以往實踐證實，氬氦刀冷凍消融術(shù)能保留更多正常肝組織，且安全性高[7]。王猛等[8]以 CT 引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)治療侵及胸膜或胸壁惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后病變得到不同程度消融。但根據(jù)梁淑貞等[9]報道，42個肝、肺惡性腫瘤病灶氬氦刀冷凍消融術(shù)后，16個病灶有腫瘤殘存，可見單一依賴氬氦刀冷凍消融術(shù)不能將全部腫瘤完全消除。

圖1 治療前后肝臟CT圖像Figure1 CT image of liver before and after treatment

表3 兩組血清T淋巴細胞亞群比較（±s）Table3 Comparison of serum T lymphocyte subsets between two groups（± s）

表3 兩組血清T淋巴細胞亞群比較（±s）Table3 Comparison of serum T lymphocyte subsets between two groups（± s）

時間術(shù)前n組別觀察組對照組t值P值觀察組對照組t值P值34 34術(shù)后3個月34 34 CD3+（%）52.66±5.32 53.21±4.88 0.444 0.658 64.48±10.23 52.97±6.19 5.613 0.000 CD4+（%）23.34±5.61 24.47±7.32 0.714 0.478 34.09±8.21 23.28±4.73 6.653 0.000 CD4+/CD8+0.86±0.17 0.88±0.16 0.499 0.619 1.27±0.24 0.84±0.20 8.026 0.000

表4 兩組CA242、CEA、CA199水平比較（±s）Table4 Comparison of CA242，CEA and CA199 levels between two groups（± s）

表4 兩組CA242、CEA、CA199水平比較（±s）Table4 Comparison of CA242，CEA and CA199 levels between two groups（± s）

時間術(shù)前n組別觀察組對照組t值P值觀察組對照組t值P值34 34術(shù)后3個月34 34 CA242（IU/mL）49.97±8.68 48.36±7.14 0.835 0.407 21.15±3.36 29.44±5.65 7.354 0.000 CEA（ng/mL）31.97±10.25 33.25±8.57 0.559 0.578 5.02±1.15 8.44±2.36 7.596 0.000 CA199（IU/mL）109.78±24.86 112.49±30.07 0.405 0.689 40.95±10.26 49.37±13.38 2.912 0.005

表5 兩組miR-21、miR-106a表達比較（±s）Table5 Comparison of the expression of microRNA-21 and microRNA-106 in two groups（± s）

表5 兩組miR-21、miR-106a表達比較（±s）Table5 Comparison of the expression of microRNA-21 and microRNA-106 in two groups（± s）

組別觀察組對照組t值P值n 34 34 miR-21術(shù)前1.46±0.23 1.51±0.19 0.977 0.332術(shù)后3個月0.28±0.08 0.34±0.06 3.499 0.001 t值28.255 34.240 P值0.000 0.000 miR-106a術(shù)前1.54±0.26 1.57±0.24 0.494 0.623術(shù)后3個月0.35±0.07 0.44±0.08 4.937 0.000 t值25.770 26.045 P值0.000 0.000

表6 兩組EORTC QLQ-C30評分比較（±s，分）Table6 Comparison of EORTC QLQ-C30 scores between the two groups（±s，score）

表6 兩組EORTC QLQ-C30評分比較（±s，分）Table6 Comparison of EORTC QLQ-C30 scores between the two groups（±s，score）

時間術(shù)前n 34 34術(shù)后3個月組別觀察組對照組t值P值觀察組對照組t值P值34 34功能量表36.88±5.91 34.31±9.27 1.363 0.178 50.18±3.88 44.36±6.35 4.561 0.000整體生活質(zhì)量量表6.80±0.32 6.84±0.29 0.540 0.591 11.09±1.74 9.25±0.76 5.651 0.000癥狀量表21.12±4.91 20.96±5.27 0.130 0.897 6.25±2.33 8.99±1.75 5.483 0.000單項測試項目20.06±2.01 19.59±1.87 0.998 0.322 7.08±1.84 10.83±1.59 8.992 0.000

近年來研究發(fā)現(xiàn)，機體不能對癌細胞產(chǎn)生主動免疫或免疫作用較弱的原因在于缺少抗原遞呈類分子，不能被T細胞識別，導(dǎo)致腫瘤組織在體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移[10]。而DC-CIK可激活T細胞因子，啟動機體主動免疫，這為細胞免疫治療癌癥提供了理論基礎(chǔ)。其中CIK來源于自體外周血單個核細胞，是類似于自然殺傷細胞的T細胞，能通過癌細胞細胞膜，裂解腫瘤細胞，且經(jīng)過體外培養(yǎng)技術(shù)獲得大幅度增長，殺傷癌細胞能力明顯增強。但研究發(fā)現(xiàn)，單獨應(yīng)用CIK時常因癌細胞產(chǎn)生抵抗作用難以取得預(yù)期療效[11]。DC是機體一種功能最強大專職抗原遞呈細胞，對T細胞活化及抵抗癌細胞免疫逃逸具有重要作用[12]。國外相關(guān)資料指出，結(jié)直腸癌患者存在不同程度DC數(shù)量減少或功能缺陷[13-15]。而體外試驗表明，DC-CIK細胞能調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)，抑制腫瘤細胞生長[16]。可見DC-CIK細胞可能有助于腫瘤治療，故有學(xué)者對此進行探討，如Zhang等[17]指出，DC-CIK 免疫治療能延長晚期非小細胞肺癌患者總生存時間；Zhang等[18]研究以DC-CIK細胞治療肝癌，發(fā)現(xiàn)患者免疫功能增強，提示DC-CIK治療非小細胞肺癌、肝癌有利于病情控制與改善。與Zhang L、Zhang J學(xué)者不同的是，本研究對象為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，聯(lián)合應(yīng)用DC-CIK細胞免疫、CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)兩種方法，結(jié)果顯示，觀察組術(shù)后3個月緩解率（61.76%），高于對照組的緩解率（20.59%），且觀察組CD3+（%）、CD4+（%）、CD4+/CD8+高于對照組（P<0.05），提示兩種方法聯(lián)合能提高結(jié)直腸癌患者的免疫功能，增強對腫瘤的殺滅作用，療效顯著。

CA242、CEA、CA199是常用血清腫瘤標志物[19-21]。邱緒文等[22]報道發(fā)現(xiàn)，CA242、CEA、CA199聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌準確性、敏感性可達95.12%、81.69%，且Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者。Huo等[23]指出，血清CEA和CA125可反映患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示觀察組術(shù)后3個月CA242、CEA、CA199低于對照組（P<0.05），提示聯(lián)合應(yīng)用DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)能降低患者血清腫瘤標志物水平，從側(cè)面印證了兩種方法聯(lián)合效果優(yōu)于單一消融術(shù)。另觀察組術(shù)后3個月功能量表、整體生活質(zhì)量量表評分高于對照組，癥狀量表、單項測試項目評分低于對照組（P<0.05），提示DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)能提高患者生存質(zhì)量。

miRNA是長度約為21～25 bp核苷酸非編碼RNA分子，具有豐富結(jié)構(gòu)、序列、豐度，因而表達方式多種多樣，能通過抑制翻譯、降解、切斷調(diào)控靶基因。目前關(guān)于miRNA對原癌基因、抑癌基因影響尚處于探索階段[24-27]。Tusong等[28]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，miR-21、miR-106a在腎細胞癌中表達水平明顯增加，提示兩者可能與腎細胞癌發(fā)生有關(guān)，而不同癌細胞增殖、浸潤受多種miRNA共同基因調(diào)控，故miR-21、miR-106a可能與其他類型腫瘤有關(guān)。Okugawa等[29]指出，miR-21 與結(jié)直腸癌患者肌肉減少癥有關(guān)，而肌肉減少是無進展生存獨立危險因素，說明miR-21與結(jié)直腸癌無進展生存時間有關(guān)。本研究對此進行探討發(fā)現(xiàn)，觀察組術(shù)后3個月miR-21、miR-106a表達量低于對照組（P<0.05），提示DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)能抑制miR-21、miR-106a表達，這可能是兩者發(fā)揮療效作用機制之一，同時亦說明miR-21、miR-106a抑制劑可能有助于結(jié)直腸癌的治療。但本研究資料有限，有待于后續(xù)深入探討。同時以往學(xué)者指出，外周血miR-21、miR-106a具有特異性循環(huán)表達特點，且穩(wěn)定性良好，具有作為腫瘤標志物潛質(zhì)[30-32]。可見 miR-21、miR-106a具有廣闊前景與研究價值。值得注意的是，本研究miR-21、miR-106a的探討基于結(jié)直腸癌，在其他惡性腫瘤中表達仍有待驗證。

綜上所述，對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者聯(lián)合應(yīng)用DC-CIK細胞免疫聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融術(shù)，能提高患者免疫功能，降低患者血清腫瘤標志物水平，增強對腫瘤的殺滅作用，提高患者生存質(zhì)量，其機制可能與抑制促癌miR-21、miR-106a表達有關(guān)，miR-21、miR-106a抑制劑可能為結(jié)直腸癌的治療提供新的思路。