2型糖尿病合并骨質疏松患者外周血中VDR mRNA表達與25(OH)D、甘油三酯的關系研究

張旋 羅麗婭 王信 肖雪 王勇朋 陽琰 王哲 朱玉玉 樊思桐 李琪

1．遵義醫科大學附屬醫院內分泌科，貴州遵義563099

2．遵義醫科大學附屬醫院骨科，貴州遵義563099

3．遵義醫科大學附屬醫院全科醫學科，貴州遵義563099

4．遵義醫科大學附屬醫院影像科，貴州 遵義563099

近年來大量的流行病學和臨床研究發現，25(OH)D與糖尿病及其并發癥等有關［1-3］。研究發現，25(OH)D具有保護胰島β細胞功能［4］、調節炎癥和免疫反應，改善骨代謝等作用［5］，且短期補充25(OH)D能改善胰島 β細胞功能［6］。骨質疏松(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨質量受損及骨強度降低，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病。根據《骨質疏松癥防治中國白皮書》，我國至少有6 944萬人患有OP，2.1億人存在低骨量［7］。OP已成為我國第4位常見慢性疾病，T2DM人群中OP的發病率也明顯高于正常對照組［8］。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、OP 這兩種疾病均已成為世界上非常普遍的全身代謝性疾病，兩者往往好發于同一個體，并且兩者發病均與維生素D缺乏、脂代謝紊亂有關。25(OH)D缺乏不僅導致糖、脂代謝紊亂，還可以影響骨轉換、抑制骨吸收，最終導致 OP［9－10］。目前對于維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR)與糖尿病之間的關系研究較多，但是關于T2DM合并OP患者血漿中VDR mRNA表達與 25(OH)D、甘油三酯(triglyceride，TG)的關系如何，目前國內外未見相關研究報道。因此，本研究從分子水平檢測外周血中VDR mRNA表達在T2DM合并骨質疏松、單純T2DM及正常對照人群的差異性，探討外周血中VDR mRNA表達與25(OH)D、TG的關系，可能為T2DM、OP的防治提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年6月至2017年5月就診于遵義醫科大學附屬醫院內分泌科門診及住院治療的初診T2DM患者100例，據骨密度測定結果分為單純T2DM組 48例［年齡(59.4±7.3)歲，男25例，女23例］、T2DM+OP組 52例［年齡(59.9±7.6)歲，男27例，女25例］;遵義醫科大學體檢中心年齡及性別相匹配的健康者90名［年齡(58.9±8.5)歲，男45例，女45例］作為對照組(NC組)。糖尿病診斷標準符合1999年WHO糖尿病診斷標準。該研究已經獲得醫院倫理委員會批準及患者知情同意。

納入標準:①絕經1年以上的女性及年齡≥60歲的男性;②18 kg/m2≤體質量指數(body mass index，BMI)≤25 kg/m2;③未接受過任何糖尿病治療措施，包括飲食、運動療法;④肝腎功能正常，無其他嚴重器質性疾病及糖尿病急、慢性并發癥;⑤正常對照組無糖尿病及痛風家族史;⑥無吸煙史及長期大量飲酒史。

排除標準:①1型糖尿病或其他特殊類型糖尿病;②有高血壓病史、心腦血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、惡性腫瘤病史，合并甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺疾病、代謝性骨病等內分泌疾病;③妊娠或哺乳期婦女或長期服用避孕藥的婦女;④近1個月內使用過影響糖、脂代謝及其他影響體內25(OH)D代謝的藥物。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿25(OH)D及生化指標的檢測:研究對象試驗前禁食12 h，禁飲8 h，空腹抽靜脈血，測血脂、血糖、胰島素。用電化學發光法測25(OH)D(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，試劑盒靈敏度為0.83 ng/mL，測量范圍為0.83～322.5 ng/mL，批內差異為(7.6±3.5)%，批間差異為(6.7±2.0)%。FINS采用電化學發光法測定含量(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，血脂包括 TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)采用全自動生化儀統一檢測，FBG采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高壓液相法測定。Real Time-PCR檢測VDR mRNA的表達。測血壓、身高、體重并計算BMI(kg/m2)，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG)×空腹胰島素(FINS)/22.5。

1.2.2 RNA的提取和DNA的合成:所有研究對象采集5 mL外周靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝。采用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞，然后用Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計檢測RNA在260 nm/280 nm波長處的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1純度符合要求。總mRNA提取試劑盒及第一條鏈合成試劑盒由Promega公司提供;Real time PCR熒光定量試劑盒由Promega公司提供。根據試劑盒說明進行操作。

1.2.3 Real time PCR熒光定量反應體系及過程:提取血漿中總RNA，以總RNA 1.5μg為逆轉錄反應模板，進行逆轉錄總的反應體積是20 μL。VDR引物正義:5’CAGGCTATCATTACGGAGTC 3’;反義:5’CTGGCATTTGTTTCTGTTCT 3’;β-acti引物正義:5’TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3’;反義:5’TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3’。反應條件:94℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃～72℃退火30 s，75℃延伸1 min，循環28～31次，72℃終末延伸5 min。退火溫度和循環次數VDR 56℃，30個循環;β-actin 57℃，28個循環。為了校正誤差，本研究利用管家基因β-actin作為內參，以待測樣品目的基因的拷貝數平均值除以該樣品內參基因的拷貝數平均值，得到目的基因的相對含量。樣品中模板的拷貝數可由SDS軟件通過所得到的Ct值從標準曲線上計算得到。

1.2.4 設計合成引物:通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)的Gene數據庫，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列號，然后用Primer-BLAST比對引物特異性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列見表1。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測定)Table 1 Specific primers used for Real-time PCR

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(珋x±s)表示，計量資料為正態分布采用兩組獨立樣本t檢驗，非正態分布則采用非參數秩和檢驗，計數資料則用卡方檢驗。采用Pearson相關分析VDR mRNA表達與25(OH)D、血糖等指標的關系，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料及臨床生化指標的比較

單純T2DM組與NC組相比，血漿25(OH)D水平減低，而 TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，血漿25(OH)D水平減低，而TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR 水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05);T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中25(OH)D水平減低，而TG水平升高，差異有統計學意義(t=24.232，P＜0.05)，FPG、2h PG、HbA1c、TC、FINS、HOMA-IR 差異無統計學意義(P＞0.05);三組間年齡、血壓、TC、HDL-C、LDL-C相互比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組一般資料及臨床生化指標比較(珋x±s)Table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

續表2各組一般資料及臨床生化指標比較(珋x±s)Continued table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

2.2 Real time PCR檢測VDR mRNA的表達

單純T2DM組與NC組相比，外周血中VDR mRNA表達水平減低(1.07±0.23 vs 2.98±0.21)，差異有統計學意義(t=21.256，P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，外周血中VDR mRNA表達水平減低(0.35±0.12 vs 2.98±0.21)，差異有統計學意義(t=23.522，P＜0.05);T2DM+OP組與單純 T2DM組相比，外周血中 VDR mRNA表達水平減低(0.35±0.12 vs 1.07±0.23)，差異有統計學意義(t=24.232，P＜0.05)(圖1)。

圖1 三組受試者血清25(OH)D水平的比較Fig．1 Comparison of serum 25(OH)D levels between three groups of subjects

2.3 Pearson相關分析結果

血漿25(OH)D 與性別、年齡、血壓、BMI、TC、HDL-C、LDL-C的相關性無統計學意義(P＞0.05);與 HbAlc、HOMA-IR、FINS、FPG、2h PG、TG 呈負相關(相關系數 r分別為－0.342、－0.353、－0.361、－0.546、－0.426、－0.342，P＜0.05);與 VDR mRNA表達呈正相關(r=0.717，P＜0.05)。詳見表3。

表3 血漿中25(OH)D水平與臨床生化指標的相關性分析Table 3 Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical biochemical indicators

3 討論

維生素D的生物學作用已經超出傳統范疇，與心血管疾病、代謝綜合征、腫瘤和免疫應答等均有關［11－12］。維生素D與糖尿病的關系已成為研究熱點，維生素D缺乏者不僅與骨質疏松有關，更易患代謝綜合征及糖尿病［13］，糖尿病患者中普遍存在維生素D水平的缺乏［14］。血清中25(OH)D與脂肪組織維生素D受體基因表達有關，并且與糖代謝有關［15］。T2DM、脂代謝紊亂及 OP，它們看似獨立的疾病，但它們三者往往并存于同一個體，使患者生活質量更趨下降，加重了家庭及社會的經濟負擔，已成為全球共同關注的健康問題。長期以來，研究T2DM發病機制時首先考慮的是血糖和胰腺，但迄今為止，T2DM發病機制研究一直未取得突破性進展。最新研究發現，血清中維生素D缺乏不僅導致OP，還可能導致糖、脂代謝紊亂，它們三者之間關系緊密，但它們之間具體的關聯機制如何，尚未闡明。目前國內外未見2型糖尿病合并骨質疏松患者血漿中VDR mRNA表達與25(OH)D、甘油三酯關系方面的相關研究報道。因此，從維生素D入手對這一問題進行探索，不僅對闡明T2DM發病機制具有重要作用，還可能對臨床早期聯合防治糖尿病、脂代謝紊亂及OP具有深遠的意義。

本研究結果示，T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中25(OH)D水平減低，而TG水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05);單純T2DM組與NC組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統計學意義(P＜0.05);T2DM+OP組與NC組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統計學意義(P＜0.05);T2DM+OP組與單純T2DM組相比，血漿中VDR mRNA表達水平減低，差異有統計學意義(P＜0.05)。導致 T2DM合并 OP人群外周血中VDR mRNA表達水平較單純T2DM及正常人群減低的原因與T2DM合并OP人群血漿25(OH)D水平更低有關，推測T2DM合并OP更容易患維生素D缺乏及脂代謝紊亂，維生素D缺乏及脂代謝紊亂可能通過下調外周血中VDR mRNA表達而導致糖尿病及OP的發生發展。

本研究結果還顯示，血漿中25(OH)D水平與HOMA-IR、TG呈負相關，25(OH)D缺乏可能通過降低機體對胰島素的敏感性，加重胰島素抵抗，導致脂代謝紊亂，引起甘油三酯水平升高。研究發現，維生素D有降脂作用，且25(OH)D與TG、LDL、TC之間存在線性負相關［16］。維生素D的生物效應是由維生素D受體介導的［17］，維生素D可以通過調節胰島β細胞內的VDR以及胰腺組織中維生素D依賴性鈣結合蛋白促進β細胞合成和分泌胰島素，減輕IR［18］。提示VDR及25(OH)D參與了糖尿病、OP的發生發展，維生素D缺乏影響糖尿病、OP發病的可能機制是:體內維生素D減低，使外周血中VDR mRNA表達減少，維生素復合物形成減少，減少維生素D的生物學效應，從而引起脂代謝及骨代謝紊亂，形成高甘油三酯血癥、骨量減少，加重胰島素抵抗，促使糖尿病、OP發病率增高;反過來，糖尿病合并OP后血漿中25(OH)D水平減低，加重高甘油三酯血癥、骨量丟失及胰島素抵抗，這就形成了一個惡性循環。因此，積極補充維生素D可能會打破這一惡性循環，降低TG水平，減少骨量丟失，從而改善IR及骨代謝，可能對T2DM、OP的聯合防治具有非常重要的作用，但其具體機制有待進一步研究探索。