骨科祛痰逐瘀方經MAPK/ERK通路誘導血管內皮細胞遷移與血管管腔形成

陳鎮秋 洪郭駒 韓曉蕊 何偉 張慶文 魏秋實*

1．廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節骨科，廣東廣州510405

2．廣州中醫藥大學嶺南醫學中心國家重點學科中醫骨傷科學實驗室，廣東廣州510405

3．加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓阿爾伯塔大學醫學院外科部，T6G 2R3

4．廣州市第一人民醫院/華南理工大學第二附屬醫院放射科，廣東廣州510006

血管形成與組織內血管化由多種細胞協同作用，主要包括血管內皮細胞(endothelia cell，EC)和周細胞(pericyte)［1］。血管內皮細胞是組織表面的單層扁平上皮，具有構成血管腔結構、吞噬異物、集體免疫等功能［2-3］。周細胞又稱Rouget細胞，它通常存在于血管內皮細胞的基膜中，通過直接接觸或者旁分泌信號，與內皮細胞發生細胞間的生物學反應，進而監視和穩定內皮細胞的成熟過程［4］。血管化在骨組織重建中發揮重要作用，血管網通過激活骨內細胞，誘導破骨細胞吸收，促進成骨細胞生成新骨，從而維持骨穩態平衡［5］。成功的藥物運用，可透過血管內皮細胞和周細胞，在骨組織中發揮重要作用。然而，在目前的藥物研發中，化學類藥物能夠發揮這一作用的較為局限，且副作用較多［6］。

活血化瘀類中藥運用于臨床由來已久，且作用顯著，可用來增強骨血管化治療效果。其中，祛痰逐瘀方(Qutan Zhuyu Decoction，QZD)由經典方劑四物湯和二陳湯有機組合而成，已被證明具有多項臨床藥理作用，如心腦血管等疾病［7-8］。在既往的研究中，本團隊已經從細胞層面和病理層面報道了QZD可以保護骨髓間充質干細胞脂肪化，從而提高移植后骨髓間充質干細胞的存活率［9-10］。然而，QZD在血管的修復重建、血管內皮細胞的遷徙和增殖作用上知之甚少，限制了QZD在骨血管化的進一步深入拓展。在本研究中，研究團隊證明了QZD通過激活類絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)促進血管內皮細胞遷移和血管管腔形成。QZD可能是增加干細胞替代療法中細胞遷移的有希望的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究采用C57BL/6小鼠共30只。性別:雄性;級別:SPF級。體質量230～250 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格編號為(SCXK(粵)2014-0035);所有動物實驗在廣州中醫藥大學動物實驗中心執行，編號為(SCXK(粵)2013-0001)，并進行標準飼養，標準鼠糧適應性飼養，室溫(23±2)℃，自由飲水，間隔光照12 h，并保持定期消毒、通風，各組小鼠按照單籠培養原則執行。臨床和動物倫理審查:動物實驗經過廣州中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2 復方QZD含藥血清制作

QZD 組成:熟地10 g、芍藥10 g、當歸10 g、川芎10 g、半夏10 g、陳皮10 g、茯苓 10 g、甘草10 g，實驗用中藥均統一購自廣州中醫藥大學第一附屬醫院。按照人與小鼠的劑量換算公式計算小鼠的每日灌胃劑量。上述藥物水煎加熱濃縮為濃度1 g/mL的藥液，4℃保存備用。給藥前將小鼠禁食6 h后采用QZD藥液灌胃。1次/d，連續7 d。末次灌胃1 h后，水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血。室溫靜置30 min后取上清液，3 000 r/min離心，分離血清，取上清液。冰凍保存備用。

1.3 細胞培養和處理

培養SVEC細胞(內皮細胞系，來自猿猴病毒轉化小鼠)和10 T1/2細胞(周細胞前體細胞，來自小鼠間充質細胞系)(由University of Western Australia徐家科教授饋贈)。細胞維持在DMEM液中進行培養。在標準培養箱中，在5%CO2和95%空氣的濕潤氣氛下及37℃下培養。將3～5次傳代的細胞用于實驗。

1.4 劃痕遷徙實驗

將SVEC細胞在24孔板中在DMEM(Sigma公司，美國)中培養。在劃痕前將細胞單層在無血清Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司，美國)中血清饑餓過夜。24 h后用移液管尖端刮擦融合細胞單層以產生劃痕傷口。然后用Opti-MEM洗滌細胞兩次以除去細胞碎片。在細胞中加入QZD含藥血清或bFGF蛋白(Thermo Fisher Scientific公司，美國)的Opti-MEM作為陽性對照在37℃溫育16 h。使用Nikon Eclipse TE2000-5顯微鏡在所選位置的0和16 h時間點捕獲時間流逝圖像，并且通過Image J軟件估計傷口區域。

1.5 管腔形成實驗

在開始實驗之前，將 SVEC細胞在無血清DMEM中血清饑餓過夜。將Matrigel Matrix(Corning公司，美國)在4℃下解凍過夜，然后使用。24 h后，將基質膠基質加入24孔板(300 μL/孔)的孔中。將板在37℃下孵育30 min以進行聚合。然后將SVEC細胞(血清饑餓過夜)接種到基質膠層上，并使其與Opti-MEM在37℃下連接30 min。然后除去培養基并用QZD含藥血清或bFGF蛋白的Opti-MEM替換作為陽性對照。將細胞在37℃下孵育24 h。使用顯微鏡捕獲5個隨機選擇的視野。使用Image J軟件量化管長度和管覆蓋面積。

1.6 免疫熒光染色

將10T1/2細胞接入六孔板中，匯合度達到70%，在細胞中加入QZD含藥血清或bFGF作為陽性對照。用2%多聚甲醛固定10T1/2細胞。PBS洗3遍。用0.2%～0.5%triton X-100對細胞透化處理;PBS洗3遍。2%BSA封閉30 min，PBS洗兩遍。加入一抗α-SMA，室溫孵育1 h;加入二抗，室溫孵育30～45 min;PBS洗4遍，每次5 min。加入0.5 μg/mL DAPI(PBS配制)染色;用PBS洗3遍;加入20 μL封片劑封片。使用顯微鏡進行觀察10T1/2狀態。

1.7 Western blot

將SVEC進行培養，在細胞中加入QZD含藥血清或bFGF作為陽性對照，經過30 min后停止反應，將SVEC細胞進行裂解備用。分別制備SDS-PAGE分離膠和濃縮膠后，放入電泳的緩沖液。細胞裂解液與上樣緩沖液充分混勻，置沸水浴中加熱，冷卻后用微量移液器吸取樣品與預染蛋白并電泳。轉膜緩沖液中制作濾紙、凝膠、PVDF膜，350 mA轉膜。取出PVDF膜置于盛有脫脂奶粉的封閉液的平皿中，置于搖床上室溫封閉1 h。傾倒封閉液，加入一抗(p-ERK1/2和 p-p38按 1∶1000稀釋，β-actin按 1∶1000稀釋，Cell signaling technology公司，美國)，搖床上室溫振蕩孵育2～4 h，孵育過夜。回收一抗，用TBST洗滌5次。加入相應鼠源二抗(1∶1000)。TBST洗滌3次，TBS洗滌1次。將發光顯色試劑盒材料混合后，加在膜上接觸反應后，放入凝膠成像系統中進行成像分析。使用Image J軟件進行半定量分析。

2 結果

2.1 QZD含藥血清誘導SVEC細胞遷移

為了研究QZD含藥血清對內皮細胞遷徙的生物學作用，使用SVEC細胞進行劃痕遷徙試驗進行測定。結果提示，與PBS對照相比，加入QZD(100 ng/mL和200 ng/mL)對SVEC細胞進行干預后可顯著增強SVEC細胞遷移(圖1)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖1 QZD含藥血清誘導SVEC細胞遷徙 A:實驗組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均有促進SVEC遷徙;B:細胞遷徙實驗計數結果(*P＜0.05)。Fig．1 QZD-containing serum induces migration of SVEC cells．A:Test group(QZD)and positive control group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted SVEC migration compared with normal control group;B:Counting result of cell migration experiment(*P＜0.05)．

2.2 QZD含藥血清誘導管腔結構形成

為明確QZD含藥血清對SVEC形成血管結構的作用，結果提示QZD含藥血清可刺激SVEC細胞中管狀結構的形成(圖2A);與PBS對照相比，加入QZD的實驗組管腔腔周長度(P＜0.05)和管腔面積(P＜0.01)顯著增強(圖2B、2C)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖2 QZD含藥血清誘導管腔結果形成 A:實驗組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均有促進SVEC管腔結構形成;B:管腔面積計數結果(*P＜0.05，＊＊P＜0.01);C:管腔腔周長度計數結果(*P＜0.05)。Fig．2 QZD-containing serum induces lumen formation．A:Test group(QZD)and positive control Group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted the formation of SVEC luminal structure compared with the normal control group;B:Counting result of tube area(*P＜0.05，＊＊P＜0.01);C:Counting results of cavity length(*P＜0.05)．

2.3 QZD含藥血清促進10T1/2細胞聚集

為了明確QZD含藥血清對周細胞的作用，采用QZD對10T1/2細胞進行干預。結果提示，QZD可促進10T1/2細胞聚集。與 PBS對照相比，加入QZD的實驗組綠色熒光增強，細胞聚集，并呈管腔狀規律性排列(圖3)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖3 QZD含藥血清誘導管腔結果形成。實驗組(QZD)、陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］較正常對照組均促進10T1/2細胞的聚集、熒光表達增強和管腔狀有序性排列Fig．3 QZD containing serum induces lumen formation．Test group(QZD)and positive control Group［+bFGF(50 ng/mL)］promoted the aggregation and fluorescence expression of 10T1/2 cells compared with the normal control group．The lumens are arranged in an orderly manner．

2.4 QZD含藥血清經MAPK/ERK通路介導SVEC分化

為了明確QZD含藥血清的作用機制，采用QZD對SVEC細胞進行干預，在15 min后收集細胞并進行Western blot檢測。結果提示，在加入QZD含藥血清后的 30 min時，pERK1/2(P＜0.01)和 p-p38(P＜0.05)的表達量較空白對照組高，但較陽性對照組弱(圖4)。bFGF(50 ng/mL)用作陽性對照。

圖4 QZD含藥血清經MAPK/ERK通路介導SVEC分化 A:實驗組(QZD)和陽性對照組［+bFGF(50 ng/mL)］的p-ERK1/2和p-p38的表達水平較空白對照組增高;B:p-ERK1/2與β-actin比值(＊＊P＜0.01);C:p-p38與β-actin比值(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)。Fig．4 QZD containing serum mediates SVEC differentiation via MAPK/ERK pathway．A:Expression of p-ERK1/2 and pp38 in test group(QZD)and positive control group［+bFGF(50 ng/mL)］increased compared with normal control group;B:p-ERK1/2 and β-actin ratio(＊＊P＜0.01);C:p-p38 and β-actin ratio(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)．

3 討論

血管內皮細胞和周細胞在骨代謝中血管重建具有重要作用，當血管內皮細胞受損時，與周細胞結合并塑造血管的能力降低，骨代謝受到極大的限制，而恢復細胞活性目前仍受到藥物的限制［3，11］。中藥復方QZD是“祛痰逐瘀法”的代表方，由二陳湯和四物湯組合而成，在臨床上廣泛運用于股骨頭壞死、創傷后骨不愈合等多種骨科疑難疾病。前期研究表明，QZD具有顯著促進BMSCs的增殖及促成骨轉化能力，進而驗證了“祛痰逐瘀法”在預防激素性ONFH可能與調控BMSCs成骨分化有關［9-10］。然而，QZD在血管內皮細胞和周細胞分化，以及血管重建的作用知之甚少。

本研究表明，QZD含藥血清可以促進SVEC的遷移，說明QZD含藥血清對于血管內皮細胞的分化具有重要的積極性。同時也間接說明了QZD促血管化的潛力可以運用于骨修復及血管重建的。但是，血管重建的過程是復雜的。在多種血管激活物和促進因子的作用下，血管內皮細胞的聚集和組合，形成了血管的基本構架［12］。周細胞毗鄰血管內皮細胞的基底部，通常以粘附或者連接的方式進行接觸。特別是在逐漸成熟的新生血管中，周細胞從基底部向頂端遷徙和成熟，填補了血管內皮細胞之間的空隙，使血管趨于穩定［13］。因此，在嘗試驗證QZD含藥血清對于血管內皮細胞的血管管腔形成作用的同時，更需要驗證QZD含藥血清對于周細胞是否具有積極作用。

本研究表明，QZD含藥血清不僅可以促進血管管腔形成、增大管腔的面積和腔面周長，同時還能增加周細胞的聚集。由此說明，QZD對于血管重建的作用具有多方面、立體化、復合性的特點。如上所述，血管內皮細胞和周細胞的構建關系影響血管化重建的效果。二者的協同作用對于需要修復的組織或器官是非常關鍵的步驟，在骨組織中同樣存在［14-15］。在不加干預的骨血管化重建治療期間，只有一小部分細胞能夠獲得有效的活性恢復和重構［16］。在機能相對下降的慢性病患者或者老年性患者則更加緩慢，甚至導致進一步的骨壞死擴張和不愈合出現。因此，借助QZD提高多細胞的血管重構和修復能力是合理的。

另外，QZD含藥血清干預血管內皮細胞的內在機制也值得關注。目前，已報道多種細胞信號傳導途徑與血管內皮細胞遷移分化的調節有關［17-19］。據報道，細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(p38)在其中起關鍵作用，并參與增強血管內皮細胞的遷移［20-21］。在本研究中，QZD含藥血清處理30 min后，ERK 1/2和p38磷酸化水平顯著增加。這些數據表明，對于QZD含藥血清所誘導的血管內皮細胞遷移與分化，ERK 1/2和p38磷酸化的激活是必需的，這也是QZD促進血管化的機制之一。

本研究使用劃痕遷徙實驗和血管形成試驗探究了QZD對SVEC分化的影響，以及對10T1/2對血管管腔成形的作用。結果提示，QZD可促進血管內皮細胞的遷移和管腔重建，且基于激活的ERK1/2和p38活化通路。盡管這一作用仍需要在活體中進行論證，但是QZD卓越的促血管化重建能力為未來的中藥精準化治療奠定了堅實的理論基礎和微觀實證依據。