LPS誘導的HepG2細胞NOTCH與LPS-TLR4-NF-κB炎癥信號通路的“會話”研究*

張 瑩，王洪巖，遲 程，徐有青

作者單位:100050北京市 首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科

在哺乳細胞，Notch信號通路有4種類型的跨膜受體，分別是 Notch1-4及其 5個配體，即Delta-like 1、3、4（Dll1、Dll3、Dll4），Jagged1（Jag1）和Jagged2（Jag2）[1-4]。在多種炎性疾病的發病過程中，都存在NOTCH信號通路被異常激活[5-7]，但其在ALD的發病機制中的作用仍不清楚。本研究體外培養HepG2細胞，加入LPS模擬酒精刺激，檢測HepG2細胞Notch信號通路和LPS-TLR4-NF-ΚB信號通路的“會話”表現，結果發現肝內Jag1-Notch1信號通路被LPS激活，LPS結合TLR4可以通過與Notch信號通路相互作用，增加了NF-ΚB及其炎癥因子的表達。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與細胞 DMEM 高糖培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細胞培養液均購自美國Gibico 公司；LPS、DAPT、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、蛋白提取試劑等購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；Western blot超敏發光試劑盒購自美國Pierce公司；RNA提取試劑、逆轉錄試劑以及QPCR試劑均購自TAKARA公司；抗Notch跨膜受體NICD抗體、抗NF-KB和抗β-actin抗體均購自美國Cell Signaling公司；HepG2細胞株購自北京協和醫學院基礎學院細胞庫。

1.2 細胞培養和刺激 取20～30代HepG2細胞，用含有10g/L非必需氨基酸、10g/L谷氨酰胺、1g/L丙酮酸鈉的DMEM培養液，加入體積分數10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，取對數生長期的細胞用于實驗。加入LPS模擬酒精刺激，處理時間為48 h:①對照組（培養基）；② LPS組（培養基+LPS 2 μg/ml）。DAPT處理HepG2細胞時，分成4組，處理時間為24 h:①對照組（培養基）；② LPS組（培養基+LPS 2 μg/ml）；③DAPT組（培養基+DAPT 10 nM）；④DAPT+LPS組（培養基+LPS 2 μg/ml+DAPT 10 nM）。

1.3 HepG2細胞NOTCH受體和配體mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法，將HepG2細胞分為兩組，其中一組加入 LPS（2 μg/ml）模擬酒精刺激48 h，分別收集對照組和實驗組細胞，采用TRIzol Reagent RNA提取試劑盒分別提取各細胞總RNA。經反轉錄后通過PCR方法分別檢測NOTCH不同的受體和配體在刺激前后mRNA水平的變化。設計Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，Jag 1、Jag 2，Dll 1、Dll 3和Dll 4引物和內參引物（表1）。首先檢驗各組有無特異性擴增產物，然后在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。擴增條件為:95℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 30 s，35 個循環。以ΔCt(目的基因)-ΔCt（內參基因）計算實驗組和對照組的ΔCt，按照ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）計算mRNA相對水平的差值，即2-ΔΔCt。

表1 Q-PCR引物序列

1.4 HepG2細胞NICD和NF-κB蛋白的檢測 采用Western blot法，細胞經 LPS、DAPT或者 LPS+DAPT培養過夜，24 h后收集細胞，提取總蛋白并進行其濃度測定，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）。脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜30 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，X膠片曝光，記錄條帶。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件行統計學分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HepG2細胞Jag 1-Notch 1信號通路因被LPS激活而水平增加 結果顯示，經過LPS刺激48 h之后，NOTCH 1 水平顯著高于對照組（P＜0.001）；同時，LPS也顯著提高了NOTCH通路的配體Jag 1水平（P＜0.001）。盡管NOTCH的另一個配體DLL 4水平也增加了，但是增加的程度遠遠不及Jag 1（P＜0.01，圖 1，表 2），表明 DLL 4 是部分被 LPS 激活。這些結果顯示LPS主要通過激活Jag 1，導致Notch 1信號通路的激活。

2.2 LPS增加Notch信號通路和NF-κB激活 經Western blot檢測Notch-NICD表達發現，LPS能夠激活NICD表達，表明LPS在增加炎癥反應的同時上調了Notch信號通路蛋白表達。同時，我們檢測了LPS對TLR4-NF-κB驗證信號通路的影響，結果LPS顯著增強了NF-κB的表達。因此，LPS在激活TLR4-NF-κB炎癥信號的同時也激活了Notch信號通路的表達（圖2）。

圖1 各組細胞NOTCH家族受體及其相對應配體mRNA水平比較

表2 各組HepG2細胞Jag 1-Notch 1信號通路mRNA水平變化

圖2 細胞NICD和NF-κB蛋白表達情況 經LPS刺激后，Notch和NF-κB蛋白表達增強

2.3 抑制Notch信號通路減少了LPS引起的炎癥信號表達 DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑，能間接抑制Notch的活性。我們分別給予HepG2細胞LPS和DAPT處理或同時給予LPS聯合DAPT處理，細胞孵育24 h后觀察Notch信號通路下游分子NICD和LPS-TLR4炎癥通路NF-κB信號表達情況，結果LPS處理后NF-κB和NICD表達增加，加入DAPT后NICD和NF-κB蛋白表達較前顯著減少，從而說明抑制Notch通路可以顯著改善LPS-TLR4引起的炎癥反應。我們還發現，僅給DAPT處理，與對照組比，對于Notch的配體NICD和NF-κB無明顯影響，進一步說明Notch信號通路是因為LPS被激活，而抑制NOtCH信號通路可以明顯減少LPS引起的炎癥信號表達增強（圖3）。

圖3 各組細胞NICD和NF-κB蛋白表達情況 在有LPS刺激下，因Notch信號通路被抑制顯著降低了NF-κB的活性

3 討論

近年來，隨著對腸道菌群和益生菌等研究的深入，腸源性內毒素血癥在酒精性肝炎發生進展過程中的作用逐漸受到重視[8-11]。越來越多的研究證實腸源性LPS血癥在ALD發病過程中有重要作用，ALD嚴重程度與血清內毒素水平呈正相關[12-16]，應用抗生素清除腸道細菌能減少內毒素血癥的來源，緩解因酒精引起的內毒素血癥和酒精性肝損傷[17，18]。慢性酒精中毒導致血漿LPS水平增加，目前對其機制研究主要集中在三個方面:1，腸道革蘭氏陰性細菌數量增加，從而釋放更多的LPS入血；2，腸道粘膜對LPS通透性增加；3，肝臟庫弗細胞對內毒素清除能力降低[19]。當LPS作用細胞表面時，Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs），比如 TLR2 和 TLR4 立即感應到LPS的存在，從而激活下游信號分子，比如IRAK1/4、TRAF6和NF-κB[2]，這些炎癥信號通路的激活加劇了肝臟的損傷。在ALD大鼠模型，注射LPS能導致大鼠脂肪肝病變的加重，甚至引起大鼠肝組織的炎性壞死。相應地，如果抑制腸道內陰性桿菌的生長以控制血漿LPS水平，則可減輕肝組織的損傷[20]。

肝內炎癥級聯反應在ALD發病過程中有重要作用。我們前期研究發現ALD小鼠模型肝內Notch1信號通路成分呈現高表達，并激活NF-κB，擴大炎癥級聯反應，從而加劇肝損傷。但是，在體外用酒精處理HepG2細胞時，卻并未發現Notch1-NF-κB的激活，說明在小鼠模型中是其他的因素激活了Notch1-NF-κB，從而引起炎癥級聯反應。在本研究中，我們發現LPS促進TLR4和Jag1/Notch1的活化，從而激活NF-κB，引起炎癥級聯反應（圖4）。綜上所述，TLR4-NF-κB和 Notch1-NF-κB 這兩條信號通路通過LPS而相互促進炎癥反應的發生，并且更重要的是抑制Notch信號可以明顯減少LPS引起的炎癥信號反應。本研究為進一步闡明ALD發病機制和治療肝損傷奠定了科學基礎。

圖4 HepG2細胞Notch與LPS-TLR4-NF-κB信號通路“會話”模式圖