蜂毒溶血肽改善非酒精性脂肪肝大鼠肝組織脂肪沉積作用及其機制研究*

王 艷，蘇 峰，李園園，李 舒

作者單位:274300山東省單縣 濟寧醫學院附屬湖西醫院消化內科（王艷，蘇峰，李園園）；錦州醫科大學附屬第一醫院消化內科（李舒）

隨著現代藥理學的發展，發現蜂毒溶血肽具有抗氧化和抗炎等作用[1-5]。我們觀察了蜂毒溶血肽對NAFLD模型大鼠血糖、血脂和肝功能的影響，以期為NAFLD的臨床治療提供理論依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品和試劑 雄性SPF級SD大鼠，體質量200～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【動物許可證號:SCXK（湘）2011-0003】。酶標儀、電泳系統均購自美國Bio-Rad公司，電子天平購自上海奔普儀器科技有限公司，全自動生化分析儀購自日本日立公司，紫外分光光度計購自上海光學儀器五廠有限公司。蜂毒溶血肽購自上海熹垣生物科技有限公司。普通飼料、高脂飼料和血清檢測試劑盒、抗核轉錄因子E2相關因子 2（Nrf2）、抗血紅素加氧酶-1（HO-1）和抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）均購自瑞士Roche公司。

1.2 NAFLD大鼠模型的構建 取40只大鼠，適應性飼養1 w。隨機將大鼠分為對照組、模型組、小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組。在對照組，給予普通飼料喂養，給予其他三組大鼠高脂飼料喂養，構建NAFLD大鼠模型。在高脂飼料喂養4 w后，分別給予蜂毒溶血肽10 μg·kg-1·d-1和100μg·kg-1·d-1皮下注射，在對照組和模型組，則給予同等量的生理鹽水皮下注射。連續給藥12 w后，常規行肝組織學檢查。

1.3 血清學檢測 使用全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平。

1.4 大鼠肝臟組織Nrf2和HO-1蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測，簡要步驟如下:取大鼠肝臟組織，剪碎，加入裂解液裂解，沸水浴下使蛋白變性，采用BCA法檢測蛋白定量，行SDS凝膠電泳，以β-actin作為內參照，實驗結束時，應用Image J圖像處理軟件計算各條帶吸光度值。

1.5 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件包處理數據。計量資料均服從正態分布，以（±s）表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。當P＜0.05時，表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織學表現情況 模型組大鼠肝細胞大小不一，胞內存在大小不等的脂肪顆粒沉積，小葉內炎性細胞浸潤；小劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝內脂肪顆粒堆積和炎性細胞浸潤減輕，而大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝細胞排列整齊，未見脂肪顆粒堆積和炎性細胞浸潤（圖1）。

2.2 各組大鼠體質量和肝質量水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠體質量和肝質量均有不同程度的下降（P＜0.05），而大劑量蜂毒溶血肽處理組動物體質量和肝質量下降更為明顯（表 1）。

2.2 各組大鼠血清AST和ALT水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清AST和ALT水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血清AST和ALT水平下降更為明顯（表2）。

2.3 各組大鼠血糖和血脂水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血糖、TC、TG和LDL-C水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血糖、TC、TG和LDL-C水平下降更為明顯（表3）。

2.4 各組大鼠血清氧化應激指標比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清SOD和GSH水平均有不同程度的升高（P＜0.05），MDA水平有不同程度的降低（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血清SOD和GSH水平升高，而MDA水平下降更為明顯（表4）。

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達情況的比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達均有不同程度的增強（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達增強更為明顯（圖2，表5）。

圖1 四組大鼠肝組織學表現 （HE，400×）

表1 四組大鼠體質量和肝質量（±s）比較

表1 四組大鼠體質量和肝質量（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數 體質量（g） 肝質量（g）對照組 10 368.0±23.6 8.8±0.7模型組 10 435.2±22.1 14.3±1.4小劑量蜂毒溶血肽 10 398.7±19.5 12.2±1.4大劑量蜂毒溶血肽 10 380.2±20.8 10.4±1.3

表2 四組大鼠血清AST和ALT水平（±s）比較

表2 四組大鼠血清AST和ALT水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數 AST（U/L） ALT（U/L）對照組 10 29.2±5.4 42.3±5.5模型組 10 159.7±18.9 77.7±6.8小劑量蜂毒溶血肽 10 122.6±14.5 69.4±7.0大劑量蜂毒溶血肽 10 88.0±10.4 49.3±6.2

表3 四組大鼠血糖和血脂水平（±s）比較

表3 四組大鼠血糖和血脂水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數 血糖（mmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L）對照組 10 4.8±0.6 1.1±0.1 0.6±0.1 0.1±0.1模型組 10 18.3±2.4① 2.8±0.3① 1.5±0.2① 0.5±0.1①小劑量蜂毒溶血肽 10 15.4±2.0①② 2.4±0.3①② 1.2±0.1①② 0.4±0.1①②大劑量蜂毒溶血肽 10 8.7±1.8①② 1.6±0.2①② 0.8±0.1①② 0.3±0.1①②

表4 四組大鼠血清氧化應激指標（±s）比較

表4 四組大鼠血清氧化應激指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數 SOD（U/L）對照組 10 95.2±8.7模型組 10 30.4±5.3①小劑量蜂毒溶血肽 10 46.7±4.9①②大劑量蜂毒溶血肽 10 82.1±6.6①②MDA（nmol/mL）4.2±0.5 13.1±1.6①10.8±1.4①②6.3±0.8①②GSH（mmol/L）9.2±1.4 2.3±0.5①4.1±0.5①②8.7±0.9①②

圖2 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達情況

表5 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達（±s）比較

表5 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數 Nrf2 HO-1對照組 10 1.5±0.2 1.3±0.1模型組 10 0.3±0.1① 0.3±0.1①小劑量蜂毒溶血肽 10 0.7±0.1①② 0.8±0.1①②大劑量蜂毒溶血肽 10 1.4±0.2② 1.2±0.1②

3 討論

本實驗采用高脂飼料喂養造模，通過檢測大鼠體質量、肝質量、血糖、血脂和肝功能指標，觀察大鼠肝組織細胞形態變化，確定NAFLD大鼠是否造模成功，驗結果表明，通過喂養高脂飼料，模型組大鼠體質量、肝質量、血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平均較對照組升高，且通過肝組織觀察到模型組大鼠肝組織肝細胞大小不一，細胞內有大小不等的脂肪顆粒沉積，組織內炎性細胞浸潤，表明NAFLD大鼠造模成功。

目前，臨床主要采取控制飲食、增加運動量和服用藥物等對NAFLD患者進行干預[6-10]。其中，治療藥物主要為降脂藥物和護肝藥物等，其效果只能暫時調節NAFLD患者血糖、血脂和肝功能指標，治療過程較長[11-13]。因此，尋找針對NAFLD治療的特效藥物勢在必行。蜂毒溶血肽是由蜜蜂毒腺分泌的一種多肽類物質，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學作用[14，15]。在NAFLD大鼠皮下注射蜂毒溶血肽干預12周，發現大鼠體質量和肝質量均較模型組大鼠降低，血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST 和 ALT 水平也降低，表明蜂毒溶血肽對NAFLD大鼠有治療作用，且隨著蜂毒溶血肽給藥劑量的增加，效果也越明顯。

據文獻報道，氧化應激反應能促進NAFLD的發生和發展[16]。當肝臟抗氧化作用超出正常能力時，肝臟就會發生氧化應激反應，導致大量的過氧化物生成，損傷肝臟細胞[17，18]。Nrf2/HO-1通路主要調控機體抗氧化能力[19]。促進Nrf2/HO-1通路激活，可有效提高機體抗氧化能力，避免氧化應激帶來的損傷[20]。本研究對蜂毒溶血肽干預NAFLD大鼠的作用機制進行了初探，實驗結果表明，與模型組比，小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清SOD、GSH水平均有不同程度的升高，而MDA水平降低。大劑量蜂毒溶血肽處理組血清SOD和GSH水平升高，MDA水平下降更為明顯。與模型組比，小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達明顯增強，而以大劑量蜂毒溶血肽處理組更為明顯。以上結果表明蜂毒溶血肽可促進Nrf2/HO-1通路激活，提升動物血清SOD和GSH水平，降低MDA水平，進而保護肝臟，減輕脂肪變程度。

綜上所述，蜂毒溶血肽對NAFLD大鼠肝臟有保護作用，可能是通過調控Nrf2/HO-1通路，促進了大鼠的抗氧化能力。由于肝脂肪變的發生機制較為復雜，可能涉及多個通路的激活和細胞因子的參與。