中藥方劑赤白湯對D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠腸道菌群的影響研究*

張 璇，唐小云，唐春銀，石學(xué)魁，王惠琦，張曉東，沈海萍，楊春輝

作者單位:157011黑龍江省牡丹江市 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院感染病科（張璇，楊春輝，王惠琦，張曉東，沈海萍）；牡丹江醫(yī)學(xué)院（唐小云，唐春銀，石學(xué)魁）

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是指各種原因引起肝細(xì)胞大面積壞死或嚴(yán)重肝功能損害，出現(xiàn)以黃疸、腹水、肝性腦病和凝血功能障礙等為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征[1-6]。目前，我國的ALF主要以病毒性肝炎、藥物性肝損害為主，且發(fā)病率逐年增加。ALF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，菌群紊亂和內(nèi)毒素血癥在ALF的發(fā)病過程中起著重要的作用[7，8]。ALF個體腸道黏膜屏障受損，腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素就會穿過腸粘膜進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)。我們研究的中藥方劑赤白湯是由白術(shù)、白芍、赤芍熬制而成，其中白術(shù)主要含有白術(shù)內(nèi)酯和揮發(fā)油等成分，具有調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動，改善消化道功能的功效[9]；白芍主要含芍藥苷和內(nèi)酯苷等多種化學(xué)成分，具有護(hù)肝、抗炎、止痛等功效[10]；赤芍主要含黃酮類、萜類等，具有護(hù)肝、抗氧化、抗內(nèi)毒素等功效[11]。本實驗采用D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)ALF小鼠，觀察了中藥方劑赤白湯對動物腸道菌群的影響，以期為ALF臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑和儀器 清潔級昆明小鼠48 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量 25～30 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供。白術(shù)、白芍、赤芍（本院），麗珠腸樂膠囊（珠海市麗珠集團(tuán)），D-氨基半乳糖（上海源葉公司），脂多糖（美國Sigma公司），Oxoid酵母粉（上海根生生物科技有限公司），冰乙酸（天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），吐溫80（寶泰克生物科技公司），無菌均質(zhì)袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包、EMB瓊脂、腸球菌瓊脂、LBS瓊脂、BS瓊脂（青島海博生物技術(shù)有限公司），YXQ-LS-30SⅡ全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋和超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州恒德儀器制造有限公司），臺式高速離心機(jī)（德國Eppendorf），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），正置顯微鏡（日本尼康有限公司），培養(yǎng)皿（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司），干熱滅菌器（日本SANYO），恒溫水浴鍋（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠），全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 中藥方劑赤白湯的制備 根據(jù)人與動物體表面積折算法，按照（1：1：1.5）熬制，首先將藥物粉碎為細(xì)末，均勻混合，然后加10倍體積蒸餾水浸泡60 min，再煮沸30 min，共煎藥2次，合并2次藥液，65℃水浴濃縮成每mL含1 g生藥的藥液，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ALF模型構(gòu)建 隨機(jī)將48只小鼠分為正常組、模型組、大劑量、中劑量和小劑量中藥組，和麗珠腸樂組，每組8只。造模前8 d，在干預(yù)組，分別給予中藥 20 g·kg-1、10 g·kg-1和 5 g·kg-1或麗珠腸樂（用生理鹽水稀釋成 0.2億活菌/ml）0.5 ml或生理鹽水0.5 mL灌胃，1次/d。然后，給予一次性腹腔注射D-氨基半乳糖（600 mg·kg-1）和脂多糖（20 μg·kg-1）誘導(dǎo) ALF 小鼠模型。8 h后，采用頸椎脫臼法處死動物。取肝臟，稱取肝臟質(zhì)量，根據(jù)公式計算小鼠肝臟指數(shù)，即肝臟指數(shù)（%）=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。取小鼠肝右葉組織，置于10%中性福爾馬林溶液中固定18 h，常規(guī)脫水、包埋、HE染色，于光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.4 血清ALT檢測 采用摘除眼球法取血，離心留取血清，使用全自動生化分析儀檢測ALT水平。

1.5 腸道菌群檢測 在實驗結(jié)束時，處死小鼠，于解剖板上進(jìn)行常規(guī)消毒，沿腹中線切開腹腔，在無菌操作條件下取出結(jié)腸部糞便0.1 g，置于無菌均質(zhì)袋中，加入0.05%無菌酵母液9.9 ml，人工拍打使糞便均質(zhì)化，再用0.05%無菌酵母液對糞便進(jìn)行10倍系列稀釋，直至稀釋至10-9倍。選擇3個稀釋度樣品，每個10 μl，滴加到相應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個稀釋度設(shè)3個培養(yǎng)基。采用平板活菌計數(shù)法計數(shù)菌落數(shù)，同一稀釋濃度取均值（x）。根據(jù)公式，計算每一個培養(yǎng)基的菌落數(shù)，即菌落形成單位（clonal formation unit，CFU）/克標(biāo)本 =x×100×稀釋倍數(shù)。1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用ANOVA分析（方差齊時，采用LSD-t檢驗，方差不齊時，采用Games-Howell法），P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)改變情況 模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索消失，有多處出血壞死灶，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤；大劑量中藥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有大量出血壞死灶；中劑量中藥組和小劑量中藥組小鼠可見肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組排列稍整齊，細(xì)胞腫脹、壞死和出血減輕；麗珠腸樂組可見大量出血壞死灶（圖1）。

2.2 各組血清ALT水平和肝指數(shù)變化 見表1。

2.3 腸道菌群 與正常組比，模型組大腸桿菌、腸球菌顯著增高（P＜0.01，P＜0.001），乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著降低（P＜0.001，P＜0.001）；大劑量組大腸桿菌、腸球菌顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；小劑量組乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著降低（P＜0.05，P＜0.05）；麗珠腸樂組乳酸桿菌顯著降低（P＜0.05）。與模型組比，大劑量組雙歧桿菌顯著增高（P＜0.05）；中劑量組大腸桿菌、腸球菌顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著增高（P＜0.001，P＜0.001）；小劑量組大腸桿菌、腸球菌顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著增高（P＜0.05，P＜0.05）；麗珠腸樂組大腸桿菌、腸球菌顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著增高（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

圖1 各組肝組織病理學(xué)改變（HE，100×）

表1 各組小鼠血清ALT水平和肝指數(shù)（±s）比較

表1 各組小鼠血清ALT水平和肝指數(shù)（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

ALT（U/L） 肝指數(shù)（%）正常組 8 36.9±7.5 5.2±0.3模型組 7 1983.3±629.0① 6.7±0.6①大劑量中藥 7 1373.5±306.7② 5.8±0.7①中劑量中藥 8 230.8±71.7①② 5.5±0.6②小劑量中藥 8 676.7±202.8①② 5.7±0.6②麗珠腸樂 8 490±119.7①② 6.0±0.5①只

表2 各組小鼠腸道菌群數(shù)量（lgCFU/糞便，±s）比較

表2 各組小鼠腸道菌群數(shù)量（lgCFU/糞便，±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 大腸桿菌正常組 8 7.6±0.9模型組 7 8.7±0.5①大劑量中藥 7 8.3±0.6①中劑量中藥 8 7.6±0.4②小劑量中藥 8 8.0±0.2麗珠腸樂 8 8.0±0.3②腸球菌8.8±0.2 9.5±0.3①9.2±0.2①8.9±0.3②9.1±0.2 9.1±0.2乳酸桿菌10.4±0.5 9.3±0.3①9.7±0.6 10.2±0.7②9.9±0.3 9.9±0.4雙歧桿菌11.2±0.5 10.1±0.4①10.7±0.6①②11.1±0.3②10.7±0.4 11.0±0.3②

3 討論

ALF臨床表現(xiàn)包括肝功能異常、凝血功能紊亂、肝性腦病等，在某些情況下，一些沒有肝病病史的患者可出現(xiàn)多器官衰竭[11]。目前，ALF的治療主要是一般支持治療，如針對病因治療、調(diào)節(jié)免疫功能治療以及防治并發(fā)癥的治療。最新的治療方案包括肝臟移植、生物人工裝置分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)（MARS）、干細(xì)胞移植治療等[12-15]。ALF的治療主要是西藥治療，而中藥在我國有著廣泛的臨床應(yīng)用，將中藥運(yùn)用于ALF的治療有著廣闊的應(yīng)用情景。

本實驗采用腹腔注射D-氨基半乳糖/脂多糖成功建立了ALF模型。與正常組比，模型組肝組織有多處出血、壞死，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤，血清ALT水平明顯增高，肝臟指數(shù)明顯增高，腸道內(nèi)大腸桿菌、腸球菌數(shù)量明顯增多，而乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯減少，說明模型組小鼠肝臟損傷嚴(yán)重并出現(xiàn)了腸道菌群紊亂。分別給予大、中、小劑量中藥灌胃，與模型組比，小、中劑量中藥組肝組織病理性出血、壞死較模型組減輕，且中劑量中藥組比小劑量中藥組肝臟損傷減輕更明顯。與模型組比，小、中劑量中藥組動物血清ALT水平顯著降低，且中劑量中藥組動物血清ALT水平比小劑量中藥組下降明顯。與模型組比，小、中劑量中藥組腸道糞便大腸桿菌和腸球菌顯著降低，而乳酸桿菌和雙歧桿菌顯著增高，證明中藥方劑赤白湯對ALF有一定的干預(yù)作用，且中劑量中藥組比小劑量中藥組效果好，而大劑量中藥組動物血清ALT水平、肝組織損傷、肝臟指數(shù)改善沒有中劑量中藥組明顯，且對腸道有害菌的調(diào)節(jié)作用與模型組相比也無統(tǒng)計學(xué)差異，證明中藥方劑赤白湯并非隨著中藥濃度的增加效果增加，而中藥最適濃度在5 g·kg-1（小劑量）～10 g·kg-1（中劑量）之間。

胃腸道是人體最大的細(xì)菌存儲庫，胃腸道內(nèi)的微生物群對宿主的健康起著重要的作用[16]。當(dāng)機(jī)體處于健康狀態(tài)時，腸道內(nèi)細(xì)菌的種類和數(shù)量相對穩(wěn)定，有利于機(jī)體的消化吸收，還能抵御一些病原菌通過腸道侵入體內(nèi)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)不可缺少的重要組成部分[17]。當(dāng)機(jī)體的腸道菌群紊亂時，腸道內(nèi)菌群可能發(fā)生易位，甚至?xí)l(fā)內(nèi)毒素血癥，而內(nèi)毒素血癥是引起ALF的誘發(fā)因素之一，因而會加重病情[18-20]。因此，重視胃腸道功能在ALF發(fā)展中的作用，早期防止胃腸道功能紊亂，可以防止病情惡化，對改善ALF病情有重要意義，這也為中藥方劑赤白湯的臨床運(yùn)用提供了理論依據(jù)。本實驗表明中藥方劑赤白湯可以促進(jìn)腸道優(yōu)勢菌的增長、抑制有害菌的生長、減少菌群易位、進(jìn)而有利于改善肝功能。中藥方劑赤白湯對肝臟的保護(hù)作用可能與其能夠調(diào)節(jié)ALF引起的腸道菌群紊亂有關(guān)。