去甲斑蝥酸鈉對肝癌異位移植瘤小鼠腸道微生態的影響初探*

裴 穎，黃 峰，殷宏振，郭化磊

作者單位:712000陜西省咸陽市陜西中醫藥大學第一臨床醫學院

去甲斑蝥酸鈉作為療效確切的抗腫瘤藥物被廣泛應用于動物實驗和臨床研究[1-4]，比如它能通過TRAIL/DR5信號誘導人肝癌細胞Hep3B凋亡[5-7]。本研究應用去甲斑蝥酸鈉處理肝癌異位移植瘤小鼠，觀察了腸道微生態的變化，初步探究了去甲斑蝥酸鈉對肝癌異位移植瘤小鼠腸道微生態的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 昆明小鼠12只，體質量（25 2）g，雌雄不限，分籠飼養，室溫保持在 20～25℃，濕度為45%～55%。所有實驗動物和飼料均購自西安交通大學實驗動物中心[許可證號:SCXK（陜）2012-003]。H22肝癌腫瘤細胞懸液（陜西中醫藥大學實驗室制備）。去甲斑蝥酸鈉注射液（四川升和藥業股份有限公司）。Buffer緩沖液、蛋白酶?K和AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（上海微基生物有限公司）。L9600A Thermal Cycler（北京萊普特科學儀器有限公司）；TG16G臺式高速離心機(鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；UV5-Nano超微量紫外分光光度計（上海柏辰生物科技有限公司）；Invitrogen Qubit Spectrophotometer（上海元析儀器有限公司）；FTC-3000TM real-time PCR儀（Thermo Fisher Scientific Company）。

1.2 肝癌異位移植瘤小鼠模型的制備 將12只小鼠隨機分為去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組，每組各4只。在無菌條件下，將制備好的H22肝癌腫瘤細胞懸液以0.2 ml/只的劑量接種于昆明小鼠左前肢腋下，復制H22肝癌異位移植瘤小鼠模型。其中去甲斑蝥酸鈉注射液組和生理鹽水處理組分別給予去甲斑蝥酸鈉0.1 mg·kg-1、生理鹽水0.2 ml/只腹腔注射，隔日1次，而對照組不給予任何干預[16]。給予動物標準飲食飼養2 w，于第15 d處死小鼠，并解剖采集腸道糞便，置入含有Buffer緩沖液的EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3 基因組DNA提取 取預處理的糞便，解凍，以15000 r/m離心，收集沉淀。按照QIAamp DNA Stool Mini Kit步驟進行DNA提取，并利用UV5-Nano超微量紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA質檢。

1.4 PCR擴增及樣品定量 根據Illumina miseq高通量測序要求，完成特異性引物的設計。forwards primer：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3’；reverse primer:5’-CAAGC AGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特異引物-3’。采用兩步PCR擴增法，首先采用特異引物（內側引物）擴增目的片段，將目的片段行膠回收，再將回收產物作為模板進行二次PCR擴增。將PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳、切膠，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收，將回收產物在FTC-3000T Mreal-time PCR儀行樣本定量，并將樣品按照等摩爾比混勻后，制備文庫，測序。

1.5 統計學分析 根據Miseq測序得到PE reads區分樣本，再用overlap關系得到的優化序列對操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行多樣性指數分析，如alpha多樣性分析，和群落結構的統計分析，如beta多樣性分析。在上述分析的基礎上，進行一系列群落結構和系統發育等深入的統計學和可視化分析，并通過anova-t test參數分析比較去甲斑蝥酸鈉注射液、生理鹽水處理組和對照組組間差異，篩選出P＜0.05差異顯著的菌群。

2 結果

2.1 基本情況 8只異位移植瘤小鼠種瘤成功，瘤徑為（11.78 3.26）mm。在12只小鼠取得糞便，每個樣本測序條數約為30 000個。

2.2 基于OTU分析的結果

2.2.1 稀釋性曲線 結果顯示，各樣本稀釋性曲線均趨向于平坦（圖1），表明測序數據量合理。

2.2.2 豐圖等級圖 結果顯示，各樣本豐圖等級曲線水平方向逐漸增寬，表示物種豐度高，而各樣本豐圖等級曲線趨于平緩（圖2），表明物種分布均勻。

圖1 釋線性曲線模式圖

2.3 群落結構組成圖 去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組糞便菌群組成在門水平和屬水平上的分部情況見圖3和圖4。

圖2 豐圖等級圖

2.4 多組間物種差異比較 根據anova_oneway分析結果顯示，門水平和屬水平上P值小于0.05（即差異顯著）的菌群分部情況見圖5和圖6。

圖3 門水平物種分布柱狀圖

圖4 屬水平物種分布柱狀圖

圖5 三組菌群門水平差異性比較

圖6 三組菌群屬水平差異比較

2.5 本研究結果分析

2.5.1 基于OTU結果的分析 通過對釋線性曲線和豐度等級圖結果分析，各測序樣本數據量合理，所包含物種量豐富，各組樣本在物種豐富度和均勻度上趨于一致，滿足進一步對各樣本群落結構和系統發育等深入的統計學和可視化分析的要求。

2.5.2 基于物種群落結構組成和多組間物種差異比較 去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組菌群組成在門水平和屬水平上存在差異，其中差異顯著（P＜0.05）的菌群結果見表1。根據多組間物種差異比較結果和各樣本物種群落結構組成比例數據處理后可知，去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組有顯著差異的菌群（P＜0.05）在門水平和屬水平上（以變形菌門和擬桿菌屬為比較對象）所占比例情況見表2。總之，去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組在群落結構組成上存在顯著差異；在門水平上，三組之間差異最顯著的菌群為變形菌門，其中去甲斑蝥酸鈉注射液組變形菌門所占比例最高；在屬水平上，三組之間差異最顯著的菌群包括擬桿菌屬和衣原體屬等，其中生理鹽水處理組變形菌屬所占比例最高。

表1 三組差異顯著的菌群結果

表2 三組菌群中變形菌門和擬桿菌屬所占比例（%）比較

3 討論

去甲斑蝥酸鈉在臨床上已證實可以抑制癌細胞增殖[8-11]。在關于去甲斑蝥素抗腫瘤的機制研究中發現，去甲斑蝥素可以阻斷肝癌細胞發生周期，從而誘導肝癌細胞的凋亡。同時，去甲斑蝥素還可以增強機體免疫功能，抑制肝癌細胞的侵襲和轉移[12-14]。本實驗經去甲斑蝥酸鈉注射液處理，H22肝癌異位移植瘤小鼠腸道菌群在門水平和屬水平上均發生了顯著的改變，可能與去甲斑蝥酸鈉在發揮抗腫瘤活性的過程中抑制肝癌細胞增殖，從而阻斷TLR通路，抑制或減少LPS水平，改善腸道微環境，從而出現腸道菌群特異性的改變有關。也可能與去甲斑蝥酸鈉增強肝癌小鼠免疫功能，修復黏膜屏障，改善炎癥反應，減少腸道內毒素，從而出現腸道菌群特異性改變有關。

此次實驗發現，去甲斑蝥酸鈉注射液組、生理鹽水處理組和對照組糞菌在屬水平上的擬桿菌屬存在特異性的改變。擬桿菌屬為革蘭氏陰性菌，是一種條件致病菌，往往會在免疫機能紊亂的情況下釋放和分泌大量的腸源性毒素和內毒素，共同導致腸道菌群失調，腸黏膜屏障受損，通過門靜脈系統進入肝臟直接造成肝臟的損傷和癌變[5-18]。未經造模的小鼠，即在對照組，糞便中所含擬桿菌屬比例較低，造模后的小鼠（生理鹽水處理組）糞便中擬桿菌屬比例顯著升高，而經藥物干預后的小鼠（去甲斑蝥酸鈉注射液組）糞便中擬桿菌屬比例又有了明顯的下降。由此我們推測，擬桿菌屬在HCC的發生、發展中存在特異性的改變。但擬桿菌屬能否作為HCC在腸道微生態中的特異性標志物，是否可以通過對腸道菌群中的擬桿菌屬進行靶向干預作為治療HCC的一個新途徑，尚待更多的實驗研究證實。

研究表明，通過調節腸道菌群失衡情況可以有效抑制HCC的發生發展。CTLA-4在發揮抗腫瘤作用時必須依賴腸道菌群。當腸道菌群缺失時，CTLA-4則無法有效地發揮抗腫瘤作用。益生菌可以提高機體免疫功能，加快機體能量代謝，有效抑制腫瘤的生長。以上研究結果表明，益生菌在抑制腫瘤生長方面有確切的效果，可能與益生菌能夠增加腸道酸性、調節腸道免疫功能、抑制酪氨酸激酶信號通路等有關。目前，改善腫瘤患者全身情況療效確切的益生菌有雙歧桿菌、乳酸菌、鼠李糖乳桿菌和部分益生菌混合制劑，如鼠李糖乳桿菌與費氏丙酸桿菌混合制劑等。不過，通過調節腸道微生態防治HCC還缺乏多中心的臨床試驗的驗證。