酒精性肝病患者血清細(xì)胞因子水平和腸道菌群分布變化研究*

延喜勝，李 偉，王 劍

作者單位:718000陜西省榆林市第一醫(yī)院消化內(nèi)科（延喜勝，王劍）；延安大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科（李偉）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量攝入乙醇導(dǎo)致的肝臟疾病，具有進行性加重的特點[1]。ALD初期僅表現(xiàn)為輕度酒精性脂肪肝，逐漸發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝硬化。當(dāng)肝細(xì)胞廣泛壞死后甚至?xí)霈F(xiàn)肝功能衰竭[2]。因此，探討ALD發(fā)生發(fā)展過程中的病理生理變化和血清學(xué)改變，以早期診斷和治療，對防止病情惡化、改善臨床結(jié)局具有重要的意義。乙醇在肝臟代謝過程中會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子，難以避免地?fù)p傷肝細(xì)胞，而促炎因子/抗炎因子失衡伴隨著ALD發(fā)病的全過程[3]。由于獨特的肝腸解剖關(guān)系，乙醇還會對腸粘膜產(chǎn)生刺激作用，影響腸道屏障功能，容易打破腸道微生態(tài)平衡，造成腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生惡性循環(huán)[4]。本研究對比分析了ALD患者與健康人血清細(xì)胞因子水平和腸道菌群分布的差異，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年4月～2018年11月我院消化內(nèi)科收治的ALD患者34例，男性30例，女性4例；年齡 32～54歲，平均年齡為（47.23±11.34）歲。飲酒史10～20年者17例，長于20年者17例。符合ALD診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中酒精性脂肪肝11例，酒精性肝炎23例。排除標(biāo)準(zhǔn):①病毒性肝炎、自身免疫性肝炎；②存在肝硬化或肝癌；③入組前1月內(nèi)接受過腸道微生態(tài)制劑治療。選擇同期在我院體檢的健康人34例作為對照，男性31例，女性3例；年齡32～55歲，平均年齡為（46.21±10.14）歲。均無飲酒史，近期未患感染性疾病。兩組年齡和性別構(gòu)成比差異無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。受試者簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 血清檢測 采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α，齊一生物技術(shù)）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，上海信裕生物科技有限公司）和核因子κB（NF-κB，上海紀(jì)寧生物科技）；采用上海寰熙醫(yī)療生產(chǎn)的YD-588B電子血糖儀檢測空腹血糖（FBG）水平。

1.3 糞菌培養(yǎng)與分離 使用無菌便盒收集受試者糞便3 g，分為3份。稀釋糞便，按照不同腸道菌群生長條件進行培養(yǎng)。其中2份在含氧的37℃培育箱中培養(yǎng)2～4 d，用于培養(yǎng)分離屬于兼性厭氧菌的糞腸球菌和大腸埃希菌；另1份在無氧的37℃培育箱中培養(yǎng)2～4 d，用于培養(yǎng)厭氧的雙歧桿菌。在培養(yǎng)結(jié)束后，采用CelsisAdvance IITM快速微生物檢測系統(tǒng)（湛江安度斯生物有限公司）檢測菌落，以菌落形成單位的對數(shù)值（lg CFU/g）表示檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS 9.2軟件行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血生化指標(biāo)比較 ALD患者血清GGT、AST、ALT和TBIL水平均顯著高于健康人（P＜0.05，表 1）。

2.2 兩組血糖和血脂比較 本組ALD患者空腹血糖（FBG）、TC和TG水平與健康人比，無顯著性差異（P＞0.05，表 2）。

2.3 兩組血清細(xì)胞因子水平比較 ALD患者血清TNF-α、IL-6和NF-κB水平均顯著高于健康人（P＜0.05，表 3）。

2.4 兩組腸道菌群比較 ALD患者糞腸球菌和大腸埃希菌數(shù)均顯著高于健康人（P＜0.05），但雙歧桿菌數(shù)顯著低于健康人（P＜0.05，表 4）。

表1 兩組血生化指標(biāo)（±s）比較

表1 兩組血生化指標(biāo)（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05

例數(shù) GGT（U/L） AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L）ALD 34 229.4±148.3① 106.9±55.7① 99.5±41.8① 35.3±8.6①健康人 34 46.7±14.5 36.2±8.4 35.6±9.7 16.4±2.3

表2 兩組血糖和血脂指標(biāo)（±s）比較

表2 兩組血糖和血脂指標(biāo)（±s）比較

例數(shù) FBG（mmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L）ALD 34 5.3±1.8 2.3±0.9 5.1±1.8健康人 34 5.2±1.3 2.2±1.1 5.1±1.6 LDL-C（mmol/L）2.1±0.6 2.0±0.5 HDL-C（mmol/L）0.9±0.2 0.8±0.1

表3 兩組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表3 兩組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05

例數(shù) TNF－α（ng/L） IL-6（pg/mL） NF-κB（ng/L）ALD 34 9.8±3.4① 0.9±0.4① 3.7±6.3①健康人 34 5.7±2.1 0.5±0.3 0.5±0.4

表 4兩組腸道菌群數(shù)（±s）比較

表 4兩組腸道菌群數(shù)（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05

例數(shù) 糞腸球菌（lgCFU/g） 大腸埃希菌（lgCFU/g） 雙歧桿菌（lgCFU/g）ALD 34 8.7±1.4① 7.6±1.2① 7.1±1.2①健康人 34 7.2±1.3 6.6±1.5 8.9±1.3

3 討論

長期酒精攝入與超過60種疾病的發(fā)病相關(guān)。我國ALD發(fā)病率逐漸升高，北方地區(qū)由酒精因素導(dǎo)致的肝硬化由3%上升至7.7%[7]。報道顯示炎癥因素在ALD的轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用[8]，乙醇激活Toll-樣受體4（TLR4）后，引起白細(xì)胞介素-12、γ-干擾素介導(dǎo)蛋白和β-干擾素等促炎因子的大量釋放，引發(fā)持續(xù)的肝細(xì)胞破壞作用。同時，由于腸-肝軸的存在，腸道微生物群也會受到影響，菌群移位后可能激發(fā)全身性炎癥反應(yīng)[9]。本研究重點關(guān)注了TNF-α、IL-6和NF-κB三種細(xì)胞因子及糞腸球菌、大腸埃希菌和雙歧桿菌三種腸道菌群分布的變化。

本研究以匹配年齡、性別相似的健康人群作為對照，比較其與ALD患者血糖、血脂發(fā)現(xiàn)FBG、TG、TC、LDL-C和HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明本組患者病情尚輕。由于肝臟強大的代償能力，輕癥ALD患者多無典型的表現(xiàn)，血糖和血脂無明顯異常，患者重視不夠，早期的就診率不高[10]。對于長期具有大量飲酒習(xí)慣的人群，尤其是折合乙醇量超過40 g/d的男性和超過20g/d的女性，應(yīng)具有定期體檢的良好習(xí)慣。ALD患者早期肝功能正常或輕度異常，在乙醇代謝物作用下相關(guān)酶類的活性輔因子B6功能降低，肝功能指標(biāo)升高不明顯[11]。在乙醇氧化產(chǎn)生乙醛過程中，通過促進脂肪酸合成和抑制脂肪酸氧化使得肝細(xì)胞脂肪變性。該過程還會引起氧自由基水平升高，抗氧化物耗竭后氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，肝細(xì)胞呼吸功能和能量代謝產(chǎn)生障礙，細(xì)胞供能不足而逐漸凋亡和壞死[12]。乙醇還能干預(yù)體內(nèi)脂肪代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)控脂質(zhì)代謝通路轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，主要有脂聯(lián)素和腺苷酸活化蛋白激酶等，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積加重[13]。產(chǎn)生乙醛的能夠與多種共價蛋白結(jié)合，形成乙醛蛋白結(jié)合物（APA）。APA進而影響脂質(zhì)過氧化過程和相關(guān)蛋白的功能，引發(fā)DNA修復(fù)蛋白功能障礙，出現(xiàn)肝細(xì)胞線粒體損傷，加重肝功能的破壞[14]。APA本身也可作為抗原，成為免疫應(yīng)答觸發(fā)點，加速肝細(xì)胞的死亡。在酒精氧化代謝的持續(xù)作用下，早期的酒精性脂肪肝開始向酒精性肝炎轉(zhuǎn)化，肝細(xì)胞脂肪變性、壞死后肝功能逐漸異常[15]。故而ALD患者血清GGT、AST、ALT和TBIL水平均顯著高于健康人。

炎癥反應(yīng)是AID患者發(fā)生肝損傷的重要機制之一。在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中，有多種細(xì)胞因子參與，作用于肝臟固有的吞噬細(xì)胞，即Kupffer細(xì)胞，引起促炎-抗炎失衡，推動著ALD患者肝細(xì)胞損傷的進程。本研究發(fā)現(xiàn)ALD患者血清TNF-α、IL-6、NF-κB 水平均顯著高于健康人。在正常情況下，少量的TNF-α有免疫調(diào)節(jié)和肝細(xì)胞保護的作用。當(dāng)ALD發(fā)病后TLR4受體激活，引起巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌大量的TNF-α。另外，內(nèi)毒素與結(jié)合蛋白和白細(xì)胞分化抗原14受體結(jié)合后，也會進一步激活Kupffer細(xì)胞，作用于TLR4的下游信號通路，引發(fā)NF-κB通路的活化和表達(dá)，提高NF-κB水平[16]。ALD患者NF-κB高表達(dá)狀態(tài)還與部分氧化酶活化有關(guān)，可增強NF-κB通路的作用并引起絲裂原活化蛋白激酶活性增強，反之促進Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α。Kupffe細(xì)胞激活除了產(chǎn)生TNF-α以外，還會產(chǎn)生前細(xì)胞因子、活性氧和多種白細(xì)胞介素，多種細(xì)胞因子協(xié)同發(fā)揮炎性損傷作用，而氧化應(yīng)激和線粒體損傷等共同機制強化了炎癥反應(yīng)的肝損傷效應(yīng)[17]。另外，IL-6也是Kupffer細(xì)胞激活后產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子之一，不同于促炎因子，IL-6具有一定的肝細(xì)胞保護作用，在緩解酒精的急性刺激反應(yīng)、抑制細(xì)胞因子表達(dá)和促進肝細(xì)胞再生方面均有作用，對糾正肝細(xì)胞脂肪變也有效果，屬于ALD患者肝功能代償機制的重要細(xì)胞因子[18]。輕度ALD患者肝細(xì)胞一般不會發(fā)生脂肪變性，可能與IL-6的生理作用有關(guān)。另外，IL-6還有一定的抗肝細(xì)胞凋亡效應(yīng)，能夠通過下調(diào)前凋亡基因作用、上調(diào)抗凋亡基因作用來降低肝細(xì)胞對酒精刺激的敏感性，發(fā)揮抗損傷效應(yīng)。

飲食習(xí)慣和外界環(huán)境能夠誘導(dǎo)腸道菌群發(fā)生改變，大量酒精攝入后容易引發(fā)腸道菌群失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，ALD患者腸道糞腸球菌和大腸埃希菌數(shù)均顯著高于健康人，而雙歧桿菌數(shù)顯著低于健康人。腸道粘膜屏障由防御素、緊密連接蛋白和免疫細(xì)胞等共同構(gòu)成[19]。長期大量飲酒者腸道粘膜完整性被破壞，尤其是高濃度酒精刺激腸道上皮，引發(fā)上皮損傷甚至死亡。酒精的代謝產(chǎn)物乙醛還會影響腸道上皮的滲透活性，內(nèi)毒素誘導(dǎo)一氧化氮和一氧化氮合酶的產(chǎn)生，改變腸粘膜正常結(jié)構(gòu)，增加腸道通透性[20]。在腸道內(nèi)正常定植的細(xì)菌開始發(fā)生移位，革蘭陰性菌得以大量繁殖生長，形成菌膜屏障。雙歧桿菌等益生菌的活性受到抑制，營養(yǎng)素競爭減弱，加之短鏈脂肪酸等有機酸的產(chǎn)生使得腸道出現(xiàn)酸性化改變，弱勢菌種的生存環(huán)境進一步受到限制。腸道菌群失調(diào)后TLR4受體對微生物識別出現(xiàn)異常，內(nèi)毒素、多肽等腸源性產(chǎn)物加重肝細(xì)胞的炎性破壞作用，使得ALD病情進一步惡化[21]。因此，在ALD的治療方面，應(yīng)重視腸道菌群的調(diào)整，適當(dāng)補充益生菌可能有助于病情的控制。

綜上所述，ALD患者存在腸道菌群紊亂和血清細(xì)胞因子高水平現(xiàn)象，兩者與ALD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，在臨床診療活動中應(yīng)引起重視。